王 培，牛麗麗，李靜宇，耿紅梅

（衡水學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，河北 衡水 053000）

0 前言

隨著對(duì)組織工程研究的深入［1?2］，各類(lèi)生物支架材料方面研究也越來(lái)越得到廣大研究者重視［3?4］。其中，PCL屬于合成高分子材料，易加工、具有優(yōu)異的生物相容性、可吸收且降解速率和強(qiáng)度可調(diào)節(jié)，成為生物支架材料的理想之選。在結(jié)構(gòu)方面，生物支架材料需為細(xì)胞遷移、分化、增殖，即組織再生提供空間，以引導(dǎo)組織的修復(fù)或重建［5?6］，因此，在結(jié)構(gòu)上需要具有適宜的孔隙率。

在人體內(nèi)放置生物支架的手術(shù)后，會(huì)出現(xiàn)一定比例的術(shù)后感染，這已成為臨床上必須解決的問(wèn)題。而在支架材料上負(fù)載藥物，可以起到術(shù)后減少或避免致病性感染的作用，同時(shí)還可對(duì)組織修復(fù)起到積極作用。CUR是1種天然產(chǎn)物，毒性低、副作用小，具有抗炎、抗癌、抗氧化等作用，這使其在醫(yī)藥方面的應(yīng)用和研究越來(lái)越受到廣泛關(guān)注［7?8］，現(xiàn)階段已制備出了CUR納米晶膠囊、CUR納米顆粒等并進(jìn)行了體內(nèi)外評(píng)價(jià)［9?10］，尤其是CUR在腫瘤預(yù)防和治療方面表現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景［11?12］。因此，本論文嘗試選用CUR作為藥物模型，制備負(fù)載CUR的支架材料，拓寬CUR在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用范圍、同時(shí)為該類(lèi)支架材料在組織工程領(lǐng)域的潛在應(yīng)用提供參考，以期“天然藥物+可降解醫(yī)用聚合物”組合模式在組織工程領(lǐng)域深入發(fā)展。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要原料

PCL，CAPA?6800，瑞典Perstorp公司；

CUR，優(yōu)級(jí)純，上海博湖生物科技有限公司；

冰醋酸，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；

殼聚糖，生化試劑，天津市大茂化學(xué)試劑廠；

磷酸鹽（PBS）緩沖溶液，99.5%，上海伊卡生化試劑廠。

1.2 主要設(shè)備及儀器

SEM，SU8000，日本日立公司；

TG，TGA4000，美國(guó)PerkinElmer公司；

可見(jiàn)分光光度計(jì)，722G，上海儀電分析儀器有限公司；

超聲波清洗機(jī)，KQ?200KDE，昆明市超聲波儀器有限公司；

恒溫水浴鍋，HW.SY11?K122，北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司；

電子天平，NVL5D11B，奧豪斯（常州）有限公司。

1.3 樣品制備

將適量PCL、CUR和殼聚糖溶于冰醋酸中，超聲溶解4 h至全溶后，加入戊二醛并搖勻，多次水洗后45℃干燥過(guò)夜，制得多孔支架。

1.4 性能測(cè)試及結(jié)構(gòu)表征

形貌分析：試樣放入液氮中冷卻30 s，取出脆斷，進(jìn)行噴金處理，然后采用SEM表征支架材料的形貌；

熱重分析：采用TG分析，稱(chēng)取5～8 mg試樣，以氮?dú)鉃楸Ｗo(hù)氣體，流速為50 mL/min，升溫速率為10℃/min，升溫范圍為30～550℃；

孔隙率測(cè)定：用比重瓶法測(cè)量材料的孔隙率，將支架質(zhì)量設(shè)定為m0（單位為g）；比重瓶裝滿(mǎn)蒸餾水25℃恒溫至少10 min，測(cè)量質(zhì)量為m1（單位為g）；支架浸入蒸餾水后，25℃恒溫至少10 min后，排出多余蒸餾水后質(zhì)量為m2（單位為g）；將支架材料從蒸餾水中取出，剩余比重瓶及蒸餾水質(zhì)量為m3（單位為g）；25℃下蒸餾水密度為ρ（單位為g/mL）；支架體積V支（單位為 mL）=（m1+m0-m2）/ρ，支架孔體積V孔（單位為mL）=（m2-m3-m0）/ρ，孔隙率ε（單位為%）=V孔×100%/（V支+V孔）=（m2-m3-m0）×100%/（m1-m3）。

載藥量測(cè)定：（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制；稱(chēng)取50 mg CUR溶于乙醇?PBS緩沖液（pH=7.4，乙醇含量30%）中，稀釋至 100 mL；分別取 0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL溶液，稀釋至50 mL，取適量溶液在426 nm處測(cè)定吸光度，得到CUR溶液的濃度（X，g/L）與吸光度（Y）的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Y=8.076 9X-0.007 4；（2）載藥量測(cè)定；稱(chēng)取適量支架材料溶于乙醇中，溶解充分后用緩沖溶液稀釋?zhuān)?26 nm處測(cè)吸光度，再通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算CUR的濃度，載藥量（z，%）按式（1）計(jì)算：

式中a——溶解出的CUR的質(zhì)量，g

b——溶解前支架材料質(zhì)量，g

體外緩釋測(cè)試：稱(chēng)取適量PCL?CUR支架材料，置于一定體積PBS（pH=7.4）模擬體液中，37℃恒溫，在426 nm處測(cè)定吸光度，再通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算CUR濃度，平行測(cè)定3組樣品取平均值，計(jì)算累計(jì)釋藥量。

2 結(jié)果與討論

2.1 支架材料形貌分析

圖1 PCL濃度為10%、CUR在支架材料中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、殼聚糖在支架材料中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.86%的支架材料的SEM照片。圖1（a）中可明顯看到CUR藥物顆粒附著在具有孔洞結(jié)構(gòu)的骨架上。如圖1（b）～（c）所示，在不同比例尺下較清晰觀察到材料的孔洞結(jié)構(gòu)，表明本實(shí)驗(yàn)制備的支架材料成功負(fù)載上了CUR且有明顯孔洞。

圖1 PCL?CUR支架的SEM照片F(xiàn)ig.1 SEM images of PCL?CUR scaffold

2.2 熱重分析

如圖2所示，300～350℃時(shí)支架材料開(kāi)始失重，PCL濃度和殼聚糖含量一定時(shí)，隨著CUR含量從1%到2%，最大失重溫度幾乎沒(méi)有變化，都在393℃附近，這說(shuō)明CUR含量對(duì)熱穩(wěn)定性幾乎沒(méi)有影響。PCL濃度和CUR含量均相同時(shí)，殼聚糖含量從2.86%到5.71%時(shí)，最大質(zhì)量損失溫度從393℃降到387℃，這可能是因?yàn)榭紫堵实脑龃髸?huì)降低材料的力學(xué)性能和穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致熱穩(wěn)定性降低。殼聚糖含量為2.86%、CUR含量為2%，PCL濃度由8%到10%時(shí)，最大質(zhì)量損失溫度從395℃變化到393℃，熱穩(wěn)定性有降低趨勢(shì)，同時(shí)可發(fā)現(xiàn)PCL濃度對(duì)熱穩(wěn)定性的影響不如殼聚糖含量變化大。

圖2 樣品的DTG曲線(xiàn)Fig.2 DTG curves of the samples

2.3 孔隙率分析

如表1所示，其他組分不變而PCL濃度由8%增大到10%時(shí)，材料孔隙率由96.42%降低到95.33%，這是因?yàn)楫?dāng)PCL濃度增大時(shí)溶液黏度增大，材料致密度增大。其他組分不變，隨著CUR含量由1%增大到2%孔隙率也稍有下降，這是因?yàn)镃UR填充了部分孔隙，使孔隙率降低。其他組分不變，殼聚糖含量為零時(shí)，支架也存在一定孔隙率，但孔隙率很低（19.09%），這可能是因?yàn)槿軇┱舭l(fā)導(dǎo)致材料有一定的孔隙率。當(dāng)殼聚糖含量為2.86%時(shí)，孔隙率為95.07%；當(dāng)殼聚糖含量為5.71%時(shí)，孔隙率為98.07%?？梢?jiàn)殼聚糖在體系中對(duì)材料孔隙結(jié)構(gòu)有顯著影響，且隨殼聚糖含量的增加孔隙率增大，這是可能因?yàn)镃S在混合過(guò)程中占據(jù)更大空間，當(dāng)材料干燥后吸水溶脹的殼聚糖脫水收縮，其原來(lái)占有的體積形成了孔隙，故而支架孔隙率更大。從而可以發(fā)現(xiàn)，殼聚糖含量對(duì)材料的孔隙率影響最大。

表1 支架材料的孔隙率Tab.1 Porosities of the scaffold materials

2.4 載藥量的影響因素分析

2.4.1 CUR含量對(duì)支架載藥量的影響

如圖3所示，其他組分一定時(shí)，隨著CUR含量增加，載藥量有明顯增加趨勢(shì)，這是因?yàn)橹挥蠧UR投藥量大支架才能有更多CUR可以負(fù)載。但隨著CUR含量超過(guò)2%，支架材料載藥量變化不大，這可能是由于支架材料負(fù)載的CUR達(dá)到飽和。

圖3 CUR含量對(duì)支架載藥量的影響Fig.3 Effect of CUR content on drug loading capacity of the scaffold

2.4.2 殼聚糖含量對(duì)支架載藥量的影響

從圖4中可見(jiàn)，載藥量誤差較小，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可信度高。PCL濃度、CUR含量一定時(shí)，隨殼聚糖含量從1.43%增加到2.86%，載藥量顯著上升，這可能是因?yàn)榭紫堵孰S之變大，與CUR接觸的表面積變大，進(jìn)而可以負(fù)載更多的CUR藥物。殼聚糖含量超過(guò)2.86%后，載藥量變化不明顯，因此本實(shí)驗(yàn)的其他配方采用殼聚糖含量為2.86%。

圖4 殼聚糖含量對(duì)支架載藥量的影響Fig.4 Effect of chitosan content on drug loading capacity of the scaffold

2.5 體外藥物緩釋影響因素分析

在30%乙醇PBS溶液（pH=7.4）的釋放介質(zhì)中，藥物釋放率如圖5和圖6所示。支架藥物緩釋中的存在2個(gè)階段，第一階段為前60 h，存在一定的突釋現(xiàn)象，藥物釋放較快；第二階段為60～90 h，曲線(xiàn)趨向平緩，藥物釋放減慢。這是因?yàn)橹Ъ芡獗砻娴乃幤纷钕群途彌_液接觸，比較易于釋放，而緩沖液不易進(jìn)入支架內(nèi)部故而藥物在后期釋放減慢。

圖5 CUR含量對(duì)藥物累計(jì)緩釋率的影響Fig.5 Effect of CUR content on cumulative drug release rate

圖6 藥物累計(jì)釋放率與殼聚糖含量的關(guān)系Fig.6 Relationship between cumulative drug release rate and chitosan content

2.5.1 CUR含量

通過(guò)圖5可以看出，CUR含量對(duì)藥物緩釋性能有顯著影響，隨著CUR含量的增加，藥物的累積釋放率增大而且釋放速率也更快。當(dāng)CUR含量為1%時(shí)，藥物的釋放速率相對(duì)于其他試樣來(lái)說(shuō)比較平穩(wěn)緩慢，緩釋性能最好。當(dāng)CUR含量為2%、3%時(shí)釋放速率相對(duì)于1%有明顯加快，這是因?yàn)殡S著CUR添加量的增加，載藥量增加，藥物與緩沖液接觸面積增大會(huì)使CUR的釋放速率逐漸增大，同時(shí)累積釋放率也得到了明顯的提高。

2.5.2 PCL濃度及殼聚糖含量

從圖7中我們可以發(fā)現(xiàn)，隨著PCL濃度降低，藥物的累積釋放率和釋放速率有增大趨勢(shì)，這是因?yàn)镻CL濃度降低，材料的致密度降低、孔隙率增大，導(dǎo)致CUR藥物顆粒的束縛減小，向外擴(kuò)散溶出的量增大。如圖6所示，隨殼聚糖含量的增加藥物的累積釋放率和釋放速率均有所增大，這是因?yàn)殡S著殼聚糖含量增加，體系交聯(lián)結(jié)構(gòu)增多，可能導(dǎo)致材料孔隙率變大，表現(xiàn)為CUR藥物在體系的累計(jì)釋放率有增大趨勢(shì)。同時(shí)也可以發(fā)現(xiàn)，PCL濃度在4%～10%變化時(shí)，90 h的累計(jì)釋放率從76.2%到80.5%變化，對(duì)支架材料的緩釋性影響不顯著。殼聚糖含量在1.43%～8.57%變化時(shí)，90 h的累計(jì)釋放率從76.2%到85.1%，跨度更大，表現(xiàn)出對(duì)緩釋性具有更明顯的影響，如圖6所示。這可能是因?yàn)闅ぞ厶呛肯鄬?duì)PCL濃度對(duì)支架材料孔隙率影響更大，這一結(jié)果與表1所示的孔隙率影響因素分析保持了一致性，也為調(diào)整體系的緩釋性能提供了新策略。

圖7 藥物累計(jì)釋放率與PCL濃度的關(guān)系Fig.7 Relationship between cumulative drug release rate and PCL concentration

2.6 體外釋藥模型分析

通過(guò)上述因素分析發(fā)現(xiàn)PCL在醋酸中濃度為10%、CUR在支架材料中含量為2%、殼聚糖在支架材料中含量為2.86%時(shí)，載藥量和緩釋性最佳。因此，該體系釋藥模型以此配方為例進(jìn)行體外釋藥模型擬合。根據(jù)《中國(guó)藥典》第二部分［13］進(jìn)行了3種擬合，如表2所示。該體系的釋藥模型采用origin軟件進(jìn)行擬合，如圖8～10所示。以R2數(shù)值判斷，1級(jí)模型擬合后的R2數(shù)值最接近1，因此該體系的釋藥行為接近1級(jí)方程，即釋藥方程為Mt=84.42（1-e-0.03t），其中Mt為t時(shí)間（單位為s）的累計(jì)釋放率，單位為%，擬合度為R2=0.996 6，表明該體系的CUR藥物釋放以擴(kuò)散為主［14］，藥物釋放的擴(kuò)散機(jī)制是指藥物和載體間以物理方式結(jié)合，通過(guò)擴(kuò)散的方式到達(dá)指定部位而發(fā)揮藥效［15］。

表2 體外釋藥模型Tab.2 In vitro drug release model

圖8 零級(jí)模型擬合結(jié)果Fig.8 Zero?order model fitting results

圖9 Higuchi模型擬合結(jié)果Fig.9 Higuchi model fitting results

圖10 1級(jí)模型擬合結(jié)果Fig.10 One?order model fitting results

3 結(jié)論

（1）CUR和殼聚糖的含量對(duì)PCL?CUR多孔支架材料的緩釋性能具有較明顯的影響，因此在制備該類(lèi)材料時(shí)，可通過(guò)調(diào)節(jié)CUR、殼聚糖含量來(lái)調(diào)控藥物釋放性能；根據(jù)釋藥模型擬合研究表明，該體系接近1級(jí)釋藥模型，以擴(kuò)散為主，同時(shí)可根據(jù)擬合方程直觀觀察釋放量的變化趨勢(shì)，為后續(xù)臨床應(yīng)用提供參考；

（2）該類(lèi)支架材料距離應(yīng)用于臨床還有很多工作需深入開(kāi)展，如大量動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)需完成、支架材料結(jié)構(gòu)的精確控制等，但隨著人們對(duì)健康生活的重視和生物醫(yī)療器械的迅猛發(fā)展，可預(yù)見(jiàn)具有抗菌性的PCL?CUR類(lèi)多孔支架材料在藥物緩釋和組織工程領(lǐng)域具有光明的應(yīng)用前景。