張艷琳 黃國(guó)付 鄒 璟 汪 敏 王昆秀

腰椎間盤退變(lumbar intervertebral disc degeneration, LIDD) 是多種脊柱疾病的主要原因，臨床常誘發(fā)下腰痛、肢體麻木等癥狀，其病理特征主要包括纖維環(huán)撕裂、軟骨終板結(jié)構(gòu)改變和椎間盤塌陷[1]。其中軟骨終板不僅是椎間盤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的基礎(chǔ)，還是椎間盤進(jìn)行物質(zhì)交換和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)的重要通路，而終板軟骨細(xì)胞(endplate chondrocytes, EPCs)是終板軟骨組織內(nèi)唯一細(xì)胞類型，負(fù)責(zé)分泌各種細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)以維持椎間盤正常生理功能。研究表明，EPCs衰老會(huì)導(dǎo)致ECM分泌減少和代謝失衡，促進(jìn)軟骨終板鈣化損傷，最終加速椎間盤退變，提示EPCs衰老可能是LIDD發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制[2]。

一、EPCs及其衰老概述

軟骨終板是位于椎體和椎間盤之間的薄層透明軟骨，承擔(dān)整個(gè)椎體的壓縮載荷，并通過(guò)彌散機(jī)制為椎間盤供給營(yíng)養(yǎng)，當(dāng)軟骨終板區(qū)域受損，相鄰椎間盤的營(yíng)養(yǎng)交換能力會(huì)明顯下降。生理?xiàng)l件下，EPCs多成群分布于軟骨陷窩內(nèi)，電鏡下觀察其表面有突起和皺褶，胞質(zhì)內(nèi)有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體以及少量線粒體[3]。正常情況下，EPCs負(fù)責(zé)合成以蛋白多糖(proteoglycan, PG)和Ⅱ型膠原為主的ECM，ECM參與組成髓核組織基質(zhì)成分，并在各種合成和分解酶的作用下維持著代謝平衡。ECM中PG分子間孔徑的大小可以影響椎間盤中電溶質(zhì)的分布轉(zhuǎn)運(yùn)，膠原纖維與椎體上下面平行排列，又相互交叉形成具有通透性的彈力網(wǎng)，大量PG黏附其上，這種結(jié)構(gòu)，使軟骨終板既具有高頻率的滲透交換功能，又具有抗皺縮和抗?fàn)繌埬芰4]。細(xì)胞衰老作為一種應(yīng)激反應(yīng)，其最初目的是消除受損細(xì)胞并保持組織再生能力，然而隨著年齡增長(zhǎng)和各種機(jī)械應(yīng)力、損傷等刺激，衰老-清除-再生的程序無(wú)法完整進(jìn)行，從而導(dǎo)致組織機(jī)能下降。EPCs衰老時(shí)會(huì)進(jìn)入不可逆的細(xì)胞周期停滯狀態(tài)，此時(shí)細(xì)胞合成蛋白質(zhì)能力減弱，ECM分泌減少，ECM代謝失衡及受壓鈣化，細(xì)胞自我修復(fù)能力降低，細(xì)胞增殖分化能力下降，繼而造成軟骨終板功能減弱和結(jié)構(gòu)紊亂。

二、EPCs衰老機(jī)制

1.DNA損傷：真核細(xì)胞在分裂間期完成DNA分子復(fù)制和蛋白質(zhì)合成，通常包括G1期、S期(DNA合成期)和G2期(蛋白質(zhì)合成期)3期， 細(xì)胞衰老時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯于G1期而失去合成DNA和有絲分裂的能力。調(diào)控細(xì)胞周期的蛋白包括細(xì)胞周期蛋白(cyclin)、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制蛋白(cyclin-dependent kinase inhibitor, CDKI)。CDK屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，目前已知其家族成員有13個(gè)(CDK1～13)，其中CDK2和CDK4主要作用于G1期和S期，啟動(dòng)DNA復(fù)制和誘發(fā)有絲分裂[6]。cyclin可與CDK組成蛋白激酶復(fù)合物(cyclin-CDK復(fù)合物)。CDKI屬于細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子，可分為Ink4家族和KIP家族，其中Ink4家族的p15、p16等通過(guò)與cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制CDK4/ CDK6激酶活性；KIP家族中的p21、p27等可單獨(dú)與CDK結(jié)合，降低cyclin-CDK復(fù)合物的活性，抑制cyclin作用，從而阻礙細(xì)胞周期正常進(jìn)行[7]。DNA損傷時(shí)，細(xì)胞為修復(fù)損傷首先啟動(dòng)損傷感應(yīng)，通過(guò)上調(diào)p53、p21等抑制cyclin-CDK復(fù)合物的活性，使細(xì)胞周期停留在G1/S期，從而誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。Hafsia等[8]研究發(fā)現(xiàn)，半乳糖凝集素3 (galectin-3, Gal-3)基因敲除小鼠的EPCs分解代謝、肥大標(biāo)志物和凋亡因子水平均升高，而Gal-3抑制劑可以顯著提高正常小鼠EPCs的凋亡率。在此基礎(chǔ)上，劉巖路等[9]研究發(fā)現(xiàn)，Gal-3抑制劑可能通過(guò)抑制cyclin或CDK活性導(dǎo)致S期減少，G2期停滯，DNA合成受損，從而抑制EPCs增殖。由此可見(jiàn)，DNA損傷導(dǎo)致cyclin、CDK、CDKI等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)異常，EPCs增殖分化能力降低，從而促進(jìn)EPCs衰老。

2.端?？s短：EPCs衰老的主要原因之一是端?？s短和端粒酶的下調(diào)。端粒在防止染色體降解、融合或重組、維持染色體的穩(wěn)定性和完整性以及確保遺傳信息的完整復(fù)制方面發(fā)揮著重要作用[10]。Zhu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞分裂或復(fù)制過(guò)程中，傳統(tǒng)的DNA聚合酶無(wú)法復(fù)制線性分子的3′端，導(dǎo)致沿著細(xì)胞系分裂的染色體逐漸縮短，端粒磨損引起復(fù)制能力的喪失，線粒體功能障礙，繼而發(fā)生細(xì)胞衰老，這種作用機(jī)制也是EPCs細(xì)胞衰老的產(chǎn)生機(jī)制之一。退行性變椎間盤會(huì)出現(xiàn)端?？s短，當(dāng)端粒縮短增加時(shí)，端粒酶延長(zhǎng)端粒的頻率也隨之增加，從而實(shí)現(xiàn)端粒長(zhǎng)度的穩(wěn)態(tài)，例如黃曉東等[12]經(jīng)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大齡鼠來(lái)源的EPCs端粒相對(duì)長(zhǎng)度更短，同生理狀況的衰老相一致。

3.氧化應(yīng)激：氧化應(yīng)激源于促氧化和抗氧化穩(wěn)態(tài)失衡，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到氧化狀態(tài)并延長(zhǎng)時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)衰老，衰老細(xì)胞中氧化蛋白質(zhì)的積累和不溶性物質(zhì)的形成大大降低了蛋白質(zhì)水解功能，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的喪失[13]。黃曉東等[12]研究表明，衰老越明顯的EPCs，總抗氧化能力越低，抵抗過(guò)氧化損傷的能力越差。生理情況下EPCs中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)細(xì)胞受到機(jī)械刺激、高氧、高糖及炎性細(xì)胞因子等刺激時(shí)ROS的產(chǎn)生增加，高水平ROS的產(chǎn)生會(huì)造成EPCs膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)的氧化損傷以及DNA損傷，是EPCs衰老的誘導(dǎo)因素之一[14]。黃曉東等[12]報(bào)道稱氧化應(yīng)激可以通過(guò)盤狀結(jié)構(gòu)域受體通路，產(chǎn)生單鏈DNA損傷信號(hào)，激活共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因(ataxia telangiectasia mutant gene, ATM)激酶活性，促進(jìn)受損DNA附近組蛋白磷酸化，上調(diào)p53/p21的活性，從而引發(fā)細(xì)胞衰老。由此可見(jiàn)，氧化應(yīng)激損傷可以引起DNA損傷，從而誘發(fā)EPCs衰老。

4.SASP紊亂：EPCs衰老除了經(jīng)歷細(xì)胞周期生長(zhǎng)停滯之外，還分泌大量炎性細(xì)胞因子和基質(zhì)蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)，包括MMP-1、MMP-3和MMP-10等蛋白，以及其他細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，這一特征稱為衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)，其中炎性細(xì)胞因子IL-6 和 IL-8可以促進(jìn)慢性炎癥、驅(qū)動(dòng)衰老并增加與年齡相關(guān)病變的風(fēng)險(xiǎn)[15]。SASP可以對(duì)鄰近EPCs和ECM產(chǎn)生分解代謝作用，導(dǎo)致軟骨終板結(jié)構(gòu)和功能的破壞。張樹(shù)文等[16]在衰老EPCs中觀察到MMP和PG水解酶水平升高。由此可見(jiàn)， EPCs細(xì)胞內(nèi)存在不平衡的基質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)，即合成代謝減少和分解代謝增加，是EPCs衰老的原因之一。

5.自噬抑制：在EPCs衰老機(jī)制中，細(xì)胞自噬是不可或缺的一部分。細(xì)胞自噬通過(guò)雙膜結(jié)合液泡隔離細(xì)胞質(zhì)成分形成自噬體，自噬體膜的啟動(dòng)、延伸、成熟及其與溶酶體的融合由不同的自噬相關(guān)蛋白介導(dǎo)，自噬體的形成隨自噬相關(guān)蛋白的整體下降而減少。研究表明，EPCs自噬與衰老密切相關(guān)，激活自噬可以相對(duì)延緩EPCs衰老，促進(jìn)細(xì)胞增殖生化過(guò)程[17]。例如Liang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以通過(guò)誘導(dǎo)自噬來(lái)保護(hù)EPCs，增強(qiáng)自噬在一定程度上可以減輕EPCs退化，而具有自噬抑制性的磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase /protein kinase B, PI3K/Akt)信號(hào)通路參與抑制EPCs的活性，并誘導(dǎo)細(xì)胞衰老與凋亡。

三、EPCs衰老對(duì)LIDD的影響

不同程度的EPCs衰老引起EPCs功能異常，包括ECM合成分泌減少、膠原結(jié)構(gòu)改變、終板基質(zhì)滲透作用減弱等，久而久之軟骨終板鈣化出現(xiàn)裂隙，結(jié)構(gòu)紊亂致使終板功能缺失。椎間盤屬于無(wú)血運(yùn)組織，其所需營(yíng)養(yǎng)主要依賴終板途徑，軟骨終板功能受損造成營(yíng)養(yǎng)通道阻塞，椎間盤的物質(zhì)交換能力明顯下降，髓核血供及營(yíng)養(yǎng)減少，髓核內(nèi)源性修復(fù)失敗而發(fā)生變性，最終椎間盤功能減弱，導(dǎo)致LIDD的發(fā)生和進(jìn)展。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，退變的椎間盤內(nèi)，由于EPCs密度迅速降低，PG和Ⅱ型膠原的分泌減少，使得椎間盤基質(zhì)中滲透壓下降和水分子損失，椎間盤抗壓能力和機(jī)械性能降低，最終導(dǎo)致椎間盤退變加速[5]。因此，闡明EPCs衰老機(jī)制對(duì)揭示LIDD發(fā)生、發(fā)展機(jī)制至關(guān)重要，有助于尋求防治LIDD的有效干預(yù)措施。

四、通過(guò)抗EPCs衰老調(diào)控LIDD進(jìn)程

1.調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)通路：不同的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白形成不同的信號(hào)通路參與調(diào)控EPCs衰老和LIDD，通過(guò)激活或抑制相關(guān)通路可以調(diào)控LIDD進(jìn)程，常見(jiàn)的信號(hào)通路包括p21、p53、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogenactivated protein kinase, p38MAPK)和Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)等信號(hào)通路[19]。例如周年等[20]通過(guò)建立人體外EPCs衰老模型，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1(sirt1)通過(guò)抑制p53/p21信號(hào)通路，來(lái)抑制白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)介導(dǎo)的EPCs衰老，從而減緩LIDD發(fā)展。張宇等[21]研究證實(shí)，羥基紅花黃素A能夠通過(guò)下調(diào)p53蛋白表達(dá)來(lái)抑制EPCs衰老，從而延緩LIDD進(jìn)程。柳根哲等[22]研究表明，益氣活血湯可通過(guò)調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路，下調(diào)大鼠椎間盤退變終板軟骨中相關(guān)mRNA與蛋白表達(dá)，抑制EPCs凋亡，從而延緩椎間盤退變。

2.激活端粒酶活性：端粒酶能夠恢復(fù)丟失的端粒DNA以減緩端粒的不斷縮短，從而保護(hù)自身遺傳信息，通過(guò)調(diào)節(jié)端粒酶活性，可以保護(hù)EPCs免受端粒磨損，減緩EPCs衰老，進(jìn)而調(diào)控LIDD進(jìn)程。端粒酶活性主要由端粒酶催化亞基(human telomerase reverse transcriptase, hTRT)表達(dá)水平的高低決定。周榮平等[23]將hTRT基因腺病毒載體導(dǎo)入椎間盤細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，hTRT基因能夠通過(guò)抑制椎間盤組織和細(xì)胞中PG以及Ⅱ型膠原的減少，有效阻抑椎間盤EPCs衰老以及LIDD。基于端粒酶的抗衰老策略，主要包括化學(xué)端粒酶激活劑、端粒酶表達(dá)激活劑和端粒酶基因治療，未來(lái)有望通過(guò)慢病毒載體等細(xì)胞療法，調(diào)控端粒酶活性，減少端?？s短，來(lái)實(shí)現(xiàn)延緩EPCs衰老、減輕LIDD的目的[24]。

3.抗氧化損傷：ROS可以參與激活多種信號(hào)通路，如核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)、p38MAPK、p53等信號(hào)通路，通過(guò)上調(diào)ECM降解酶和促炎性細(xì)胞因子，下調(diào)ECM合成代謝的基因，影響MMP、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)和PG等多種蛋白表達(dá)，從而調(diào)節(jié)EPCs的自噬、衰老與凋亡[25]。例如Zhou等[26]研究表明，促氧化劑H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激激活了p53/p21 通路，導(dǎo)致EPCs衰老。并且Yang等[27]研究發(fā)現(xiàn)，H2O2和IL-1β均可以使EPCs中PG和Ⅱ型膠原蛋白的 mRNA 水平降低，而抗氧化劑谷胱甘肽可以有效防止這種有害作用。這表明谷胱甘肽等抗氧化劑可以通過(guò)減輕氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的EPCs衰老，保護(hù)椎間盤結(jié)構(gòu)和功能正常，而成為治療LIDD的一種可行性選擇。

4.維持SASP穩(wěn)態(tài):參與組成SASP的信號(hào)通路蛋白有NF-κB、p38MAPK、IL-1β等，通過(guò)激活或抑制相關(guān)信號(hào)通路，可以調(diào)控SASP的分泌表達(dá)，消除炎性細(xì)胞因子對(duì)EPCs的損害，進(jìn)而保護(hù)終板軟骨，有望成為治療LIDD的手段之一。NF-κB是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，它參與機(jī)體的炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答，能調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)，控制DNA轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞存活。Ngo等[28]研究發(fā)現(xiàn)，DNA損傷時(shí)上游p38MAPK通路通過(guò)激活NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)節(jié)SASP的表達(dá)和分泌，促進(jìn)IL-6、IL-8和TNF-α的表達(dá)。王剛良等[29]研究發(fā)現(xiàn)，石蒜堿能夠通過(guò)阻斷EPCs內(nèi)IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路，減少M(fèi)MP-3和MMP-13的表達(dá)，來(lái)保護(hù)軟骨終板，延緩LIDD。這表明通過(guò)減弱分解代謝信號(hào)可以糾正SASP失衡，促進(jìn)EPCs的去分化和再分化，糾正ECM降解和合成代謝之間的紊亂，從而促進(jìn)椎間盤修復(fù)與再生，延緩LIDD進(jìn)展。

5.激活自噬:自噬對(duì)軟骨終板和椎間盤的保護(hù)作用，與自噬參與調(diào)控EPCs代謝有關(guān)。研究表明，自噬激活可以增加EPCs中Ⅱ型膠原的分泌，抑制MMP-13分泌，從而發(fā)揮保護(hù)椎間盤的作用[30]。例如Yu等[31]研究發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)基因微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈3(microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3, LC3)和自噬效應(yīng)蛋白1(beclin-1)的表達(dá)隨著終板軟骨細(xì)胞活性的降低而顯著降低，自噬活性可能與椎間盤的發(fā)育和退變有關(guān)。左睿等[32]在構(gòu)建小鼠軟骨終板退變的模型上，發(fā)現(xiàn)氯喹抑制自噬時(shí)軟骨終板退變加重，而雷帕霉素激活自噬可以對(duì)EPCs起保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)激活核因子E2相關(guān)因子2和(或)胞質(zhì)蛋白Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(nuclear factor erythroid-2 related factor 2/the kelch-like ECH-associated protein 1,Nrf2/Keap-1)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)抗氧化蛋白表達(dá)，清除活性氧，減少EPCs衰老并維持其分化潛能來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此，通過(guò)激活EPCs內(nèi)自噬水平來(lái)抑制軟骨終板退變可以為減輕椎間盤退變提供新的治療方向。

五、展 望

綜上所述，研究EPCs衰老機(jī)制對(duì)LIDD的預(yù)防和治療具有重要價(jià)值。EPCs衰老主要與DNA損傷、端?？s短、氧化應(yīng)激、SASP紊亂和自噬抑制等有關(guān)，通過(guò)減輕DNA損傷、激活端粒酶活性、抗氧化損傷、維持SASP穩(wěn)態(tài)、激活細(xì)胞自噬等途徑可以減輕EPCs衰老，保護(hù)EPCs合成分泌蛋白功能，維持ECM合成分解代謝平衡，保護(hù)軟骨終板生理結(jié)構(gòu)和功能，保障椎間盤的結(jié)構(gòu)支撐和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，從而延緩LIDD進(jìn)程。通過(guò)保護(hù)EPCs來(lái)保護(hù)椎間盤的方法，可以為將來(lái)更成熟的細(xì)胞移植技術(shù)提供理論支撐，也為臨床上防治LIDD相關(guān)疾病提供了新的思路。只是目前大多數(shù)研究尚處于細(xì)胞模型和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，缺少人體實(shí)驗(yàn)及臨床研究數(shù)據(jù)，尚不明確這些途徑是否能夠在促進(jìn)EPCs增生的同時(shí)保護(hù)其功能正常。另外目前關(guān)EPCs衰老的研究方向也比較單一，例如涉及到相關(guān)通路抑制劑和激動(dòng)劑的使用，多停留在單方向通路研究，而多通路抑制劑或激動(dòng)劑聯(lián)合使用是否能發(fā)揮更好的作用，如何鎖定核心作用機(jī)制尚不明了，因此今后應(yīng)在不斷完善分子機(jī)制研究的基礎(chǔ)上積極開(kāi)展相關(guān)的臨床應(yīng)用研究，去探尋更完善的治療靶點(diǎn)。