謝金根,李文宏（江西中醫(yī)藥大學,江西 南昌 330004）

缺血性心臟?。↖HD）是當前心血管疾病最主要的死亡原因之一，僅在2019年，因IHD死亡的患者高達914萬例[1]，IHD以心肌缺血為表征，臨床多出現(xiàn)心絞痛、心肌梗死等癥狀[2]。目前臨床治療IHD主要是通過溶栓、冠狀動脈旁路移植術等方式改善缺血情況[3]，但心肌在缺血時可能已經發(fā)生病變，在重新供血供氧的情況下病變心肌可能會因為能量代謝異常，不可避免地加重原本受損的心臟[4-5]。

硝酸甘油是血管擴張劑，可以迅速改善缺血心肌的供血供氧，有效緩解心絞痛及其相關的疼痛[6]，同時降低心臟前負荷，降低心肌耗氧量，是心血管疾病最常用的藥物[7]，已有一個多世紀的應用歷史，其劑型也多種多樣，國內外市場上較常用的劑型包括注射劑、透皮貼劑、片劑、氣霧劑等。其中氣霧劑具有使藥物均勻分散，起效快，生物利用度高，能避免肝臟的首過效應等優(yōu)點，在局部用藥時常優(yōu)于其他劑型[8]。硝酸甘油氣霧劑常規(guī)用藥部位為舌下給藥，但生物利用度個體差異大，達到最大血藥濃度后迅速下降，作用維持時間短，且不適用于心絞痛發(fā)作時的暈厥患者。經皮給藥雖然吸收較差、不規(guī)則，但作用維持時間長，適用于預防心絞痛的發(fā)作或牙關緊閉的暈厥患者。本研究主要考察硝酸甘油氣霧劑皮膚給藥對心肌缺血的影響，為硝酸甘油氣霧劑皮膚給藥合理性提供理論依據(jù)，提高臨床治療水平。

1 材料與方法

1.1 儀器 BL-420F生物信號采集處理系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；生物組織石蠟包埋機（德國Leica公司）；輪轉式石蠟切片機（德國Leica公司）；恒溫攤片機（德國Leica公司）；ELX800吸收光酶標儀（美國BioTek儀器有限公司）；光學顯微鏡（德國Leica公司）；恒溫烘箱（上海一恒科學儀器）；離心機（湖南湘儀）。

1.2 藥物及試劑 硝酸甘油氣霧劑（濟寧為民制藥有限公司）；異丙腎上腺素注射液（上海禾豐制藥有限公司）；水合氯醛（麥克林）；蘇木精-伊紅染色液（南昌雨露實驗器材有限公司）；SOD、GSH-PX、MDA生化試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 試驗動物 36只健康成年SPF級雄性SD大鼠（250g-300g）由北京科瑞斯實驗動物有限責任公司提供，動物合格證號SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)條件：室溫為23℃-25℃，相對濕度（55%±10%），明暗條件（12/12明暗比），自由飲水、喂飼。

1.4 方法

1.4.1 動物分組 將36只雄性SD大鼠隨機分為正常組、模型組、舌下給藥組（0.1mg/kg）、皮膚給藥組（低、中、高劑量組分別為0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.9mg/kg）共六組，每組6只。

1.4.2 造模、給藥以及心電圖的采集 大鼠腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后固定于鼠板上，左胸備皮，四肢插入大頭針連接生物信號采集處理系統(tǒng)檢測，記錄大鼠Ⅱ導聯(lián)心電圖10min，剔除心律異常的大鼠后，隨機分組。正常組于皮下多點注射等體積的生理鹽水，其余各組給予5mL/kg ISO造模后，正常組和模型組經皮給予等體積的無水乙醇，給藥組按照不同給藥部位給予相應劑量硝酸甘油，每天一次，連續(xù)三天。第三天麻醉、記錄心電圖10min后，同上法復制心肌缺血模型，并給予相應受試藥物，記錄心電圖30min，觀察J點（QRS波群的終點與ST段交接處）變化的絕對值（|ΔJ|），|ΔJ|=|給藥后J點值-造模前J點值|。

1.4.3 大鼠血清及心肌組織樣本提取與保存 心電圖采集結束后，腹主動脈取血，靜置2h，3500r/min離心10min，吸取上清液分裝，-80℃保存?zhèn)溆?。采血后，打開胸腔，迅速摘取心臟，以預冷PBS洗盡殘血，放置于4%的多聚甲醛固定48h。

1.4.4 大鼠血清中SOD、GSH-PX、MDA含量測定 嚴格按照試劑盒使用說明檢測血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）和丙二醛（MDA），酶標儀檢測吸光度。

1.4.5 HE染色觀察大鼠的心肌組織病理學變化 取同一位置的心肌組織，乙醇（75%、85%、95%、100%）梯度脫水；后經二甲苯透明；充分浸蠟、石蠟包埋；切片機切片、攤片，每例動物切3片，切片厚度5μm；石蠟切片置于恒溫箱中60℃烤片1h；迅速使用二甲苯脫蠟；乙醇（100%、95%、85%、75%）梯度水化；蘇木素染核；1%鹽酸分化，2%碳酸氫鈉反藍；85%乙醇脫水；伊紅染質；100%乙醇脫水；二甲苯透明；中性樹脂封片，倒置顯微鏡觀察拍照，觀察心肌組織的病理狀態(tài)。

2 結果

2.1 硝酸甘油氣霧劑對ISO致大鼠心肌缺血心電圖的影響 與正常組相比，模型組的|ΔJ|顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，舌下給藥組的|ΔJ|在給藥后顯著降低（P＜0.01），在給藥30min時，|ΔJ|有所回升；低劑量組的|ΔJ|在給藥后逐漸下降，且在30min時顯著降低（P＜0.01）；中劑量組的|ΔJ|在給藥15min時顯著降低（P＜0.01），30min時沒有回升趨勢；高劑量組|ΔJ|在給藥15min時顯著降低（P＜0.01），但|ΔJ|在30min時有所回升。見表1。

表1 硝酸甘油氣霧劑對ISO致大鼠心肌缺血的|ΔJ|影響(±s,n=3)

表1 硝酸甘油氣霧劑對ISO致大鼠心肌缺血的|ΔJ|影響(±s,n=3)

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

|ΔJ|2min 5min 15min 30min正常組 - 0.007±0.031 0.005±0.024 0.009±0.025 0.007±0.013模型組 - 0.208±0.029## 0.209±0.025## 0.203±0.011## 0.215±0.016##舌下給藥組 0.1 0.066±0.038** 0.033±0.030** 0.073±0.051** 0.135±0.029低劑量組 0.1 0.147±0.022 0.125±0.016* 0.113±0.032* 0.013±0.050**中劑量組 0.3 0.131±0.039 0.105±0.033* 0.070±0.054** 0.050±0.064**高劑量組 0.9 0.180±0.025 0.117±0.002* 0.075±0.017** 0.151±0.026組別 劑量（mg/kg）

2.2 SOD活力 如圖1所示，與正常組相比，模型組SOD活力降低（P＜0.05）；與模型組相比，給藥組SOD活力顯著升高（P＜0.01）。

2.3 GSH-PX活力 如圖2所示，與正常組相比，模型組GSH-PX活力顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，給藥組GSH-PX活力顯著升高（P＜0.01）。

2.4 MDA含量 如圖3所示，與正常組相比，模型組MDA含量升高，但無統(tǒng)計學差異；與模型組相比，高劑量給藥組有顯著性差異（P＜0.01），其余給藥組MDA含量有下降趨勢，無統(tǒng)計學意義。

2.5 硝酸甘油氣霧劑對ISO致大鼠心肌缺血的心臟組織形態(tài)的影響 如圖4所示，正常組的心肌細胞結構完整，細胞膜正常，絕大部分心肌纖維排列正常，未見炎性細胞浸潤、纖維變性和壞死；模型組心肌細胞空泡化嚴重、間質水腫、部分心肌纖維排列紊亂、斷裂、束膜溶解卷曲、炎性細胞浸潤、核仁不明；與模型組相比，各給藥組心肌細胞空泡化減少、心肌纖維排列紊亂、斷裂、束膜溶解卷曲情況得到改善，炎癥反應減輕。

根據(jù)心臟病理特征綜合評分[9-10]，選取五個評分項（心肌細胞空泡化，心肌細胞間質出血和水腫，心肌纖維排列紊亂、斷裂，炎性細胞浸潤，心肌細胞壞死、自溶）。參照病理實驗結果，按心肌損傷嚴重程度進行評分，每個評分項最低得分0分，最高得分3分：無病變者記0分；輕度損傷者記1分；中度損傷者記2分；重度損傷者記3分。統(tǒng)計每組樣本評分項的總分，分值越高代表心肌損傷越嚴重。見表2。

表2 硝酸甘油氣霧劑對ISO致大鼠心肌缺血的心臟組織形態(tài)的影響(n=6)

3 討論

心肌缺血是指心臟的血液灌注量減少、心肌供氧量不足，導致能量代謝異常，心臟不能正常工作的病理狀態(tài)[11]。ISO是一種合成兒茶酚胺類β腎上腺素受體激動劑，過量或長期使用時可產生高度細胞毒性的自由基引起心肌嚴重氧化應激，造成不可逆轉的細胞損傷，從而導致以室性期前收縮為表現(xiàn)的缺血性心律失常[12-13]。本研究通過皮下多點注射ISO的方式制造大鼠心肌缺血模型，以|ΔJ|≥0.1mv視為心肌缺血造模成功[14]。實驗結果顯示，與模型組相比，硝酸甘油給藥組均可降低|ΔJ|值，其中舌下給藥組起效時間最快，皮膚給藥組隨著劑量的增加，起效時間也在減慢；同時各給藥組心肌細胞空泡化減少、心肌纖維排列紊亂、斷裂、束膜溶解卷曲等癥狀得到改善，炎癥反應減輕。因此，硝酸甘油氣霧劑皮膚給藥可能通過皮膚滲透到血液中，產生與舌下給藥相同的藥理作用，發(fā)揮對心肌組織的保護作用。

在缺血性心律失常中活性氧（ROS）的過度產生起重要作用，丙二醛（MDA）是體內ROS過氧化生物膜中的多價不飽和脂肪酸產生而形成的脂質過氧化終產物，SOD和GSH-PX是體內清除ROS的關鍵酶[5]，其活性的變化可以反映機體清除ROS、抗氧化損傷能力。實驗結果顯示，硝酸甘油給藥組的大鼠血清中SOD、GSH-PX活力明顯升高（P＜0.05），MDA含量都有下降趨勢，表明硝酸甘油氣霧劑可能通過升高SOD、GSH-PX等內源性氧自由基清除酶的活性，增加其抗氧化能力，減輕病變心肌的氧化應激。

硝酸甘油作為心腦血管疾病常用藥物，臨床上治療多為舌下給藥，吸收速率快，能夠迅速發(fā)揮療效，緩解癥狀。本研究發(fā)現(xiàn)，硝酸甘油氣霧劑能通過皮膚降低|ΔJ|值，維持心肌組織結構完整，通過提高大鼠血清SOD、GSH-PX的活力，降低MDA的含量來發(fā)揮對心肌的保護作用。并且隨著給藥劑量的增大，發(fā)揮作用的時間以及癥狀情況會隨之改善。有研究表明，隨著硝酸甘油的劑量增加，對冠心病心絞痛臨床治療的療效也會隨之增加，且不會增加藥物的不良反應[15]。在皮膚給藥中，也許可以根據(jù)癥狀，適當增加給藥劑量，達到最佳療效。值得注意的是：在本實驗過程中，給藥組大鼠均出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，其中皮膚給藥組各死亡3只，舌下給藥組死亡1只，其原因可能是硝酸甘油主要通過上調NO/cGMP通路而舒張血管平滑肌，導致血壓過度下降，并會反射性引起交感神經興奮，加重心臟負擔，增加ISP的心臟毒性而出現(xiàn)死亡，具體原因，還有待深入研究。