★ 付陽陽 康知然 戴大城 龔利 房敏 孫武權（上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院推拿科 上海 200437）

膝骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是老年人常見的退行性病變，臨床表現(xiàn)為關節(jié)疼痛、絞鎖、下肢功能障礙，嚴重者可伴有關節(jié)腫脹、肌肉萎縮等。據(jù)國內外初步調查，全世界KOA的患病率約為4%～13%［1］。在中國，調查發(fā)現(xiàn)40歲以上人群的患病率為10%～17%，60歲以上則達50%，而在75歲以上人群患病率高達80%［2］。KOA在中老年人中不僅有較高的患病率，且嚴重影響人們日常工作、生活，導致生活質量下降，且KOA高居全球致殘因素第12名［3-4］，為家庭與社會都帶來了較大的經(jīng)濟負擔。隨著研究進展，膝骨關節(jié)炎的發(fā)病機理主要與關節(jié)局部因素、全身因素及個體遺傳因素有密切關系，而目前公認的機制當屬關節(jié)軟骨及軟骨下骨受到直接或間接的壓力和磨擦損傷，導致軟骨細胞或基質受損、丟失，引發(fā)KOA。

整合素是由α、β亞單位組成的異質二聚體黏附糖蛋白受體。整合素可以調節(jié)軟骨細胞與膠原、纖維連接蛋白、層黏連蛋白等細胞外基質（ECM）的結合，并在生長、分化、遷移和基質合成等過程中起著關鍵的信號轉導作用［5］。早期研究發(fā)現(xiàn)，某些整合素的表達水平在膝骨關節(jié)炎的發(fā)病與進展過程中出現(xiàn)改變與成骨細胞、軟骨細胞黏附、連接、調節(jié)細胞骨架及調控軟骨細胞凋亡有關［6-8］。

為了深入探索整合素對于KOA發(fā)病及進展的調控機制，通過總結近10年來與膝關節(jié)炎的關聯(lián)較為密切的整合素α5β1、α1β1相關的實驗研究，從α5β1、α1β1整合素調控細胞外基質及細胞內信號轉導等方面分析整合素在KOA發(fā)病機制中的調控作用與相關性，旨在為KOA發(fā)病機制的進一步探索提供新的思路與方向。

1 整合素的基本結構

從結構上看，整合素有α和β兩條支鏈，在空間上兩條長鏈平行并于胞外尾端匯合的倒置“U”字形結構。到目前為止已知的有16個α支鏈和8個β支鏈，共組成24種整合素［9］。α亞基與β亞基的功能有所不同，α亞基調控整合素與陽離子依賴性配體的識別，β亞基則調控胞內骨架的相互作用和胞內信號傳導以及調節(jié)細胞的生物學功能［10］。

2 整合素α5β1參與調控KOA發(fā)病

2.1 整合素α5β1調控細胞外基質的信息轉導

整合素α5β1是細胞外基質中纖維黏連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）的重要受體。其α5亞基可以識別FN分子中RGD序列(Arg-Gly-Asp，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)。Pulai J等［11］發(fā)現(xiàn)將人新鮮分離的軟骨細胞置于低密度聚L-賴氨酸的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)時死亡，但在含F(xiàn)N的培養(yǎng)基中顯示存活率＞95%，且加入針對α5亞基的單克隆阻斷抗體后發(fā)現(xiàn)軟骨細胞在FN培養(yǎng)環(huán)境中的存活受到明顯抑制。提示α5亞基是FN的特異性受體，其與FN結合后能夠傳導軟骨細胞的存活信號，且兩者結合阻斷后會引起存活信號下調與軟骨細胞凋亡。

在體外實驗中，Inoue T等［12］將α5β1或RGD肽片段的抗體注射于大鼠胚胎的上肢部分后發(fā)現(xiàn)其比對照組大鼠的上肢生長速度緩慢，亦證實了整合素與FN結合對于軟骨的成骨作用。因此，可推測α5和FN結合的環(huán)節(jié)受阻與破壞能夠部分解釋KOA中軟骨細胞的損傷。

Maylin A B等［13］發(fā)現(xiàn)在以細胞外基質降解為主的骨關節(jié)炎中，軟骨細胞基質的合成和降解平衡顯著改變，而造成這種不平衡的原因之一是整合素α5β1與可溶性FN片段而不是不溶性FN連接，從而誘導基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達。MMP-3是一種基質金屬蛋白酶，屬于參與降解Ⅱ型膠原的過程，也使與透明質酸相連的可聚蛋白多糖由于網(wǎng)絡的松解而丟失，從而破壞關節(jié)軟骨。研究者利用α5β1與FN結合缺陷的小鼠（col2acre；Fn1RGE/fl）與野生型小鼠進行對照，在5個月大時，通過中等機械負荷的強迫運動或高機械負荷的部分切除半月板強迫運動對膝關節(jié)施加壓力。未訓練對照組的缺陷小鼠的關節(jié)軟骨正常，而暴露于高機械負荷組小鼠出現(xiàn)以蛋白多糖和Ⅱ型膠原丟失為特征的骨關節(jié)炎。發(fā)現(xiàn)Col2a-Cre；Fn1RGE/fl小鼠關節(jié)軟骨關節(jié)炎的進展明顯快于野生型小鼠。研究者同時觀察到α5β1與FN結合缺陷小鼠的關節(jié)軟骨中MMP-13和MMP-3金屬蛋白酶的表達增加，嚴重影響了基質重塑。提示FN-α5β1黏附作為細胞外基質傳感器在關節(jié)軟骨再生情況下作用十分關鍵。

作為軟骨細胞與細胞外基質結合的主要參與者，當有外力作用于軟骨時，軟骨細胞感受外在的應力刺激信號并通過整合素將外力信號轉換為細胞信號并調節(jié)細胞行為與細胞外基質環(huán)境以適應外力負荷，此過程被稱作機械轉導［14］。其中，外力刺激信號經(jīng)過細胞外基質到達整合素是整個機械轉導的第一步。適量的應力刺激有利于軟骨細胞的增殖與分化，但研究顯示過量的外力刺激會造成反作用。張麗萍等［15］將小鼠進行伸直位固定制動法造模成KOA模型一定時間后觀測小鼠β1-mRNA與β1蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠的β1-mRNA與β1蛋白的表達水平明顯低于空白組。伸直位固定制動法增加了小鼠關節(jié)軟骨的所受應力，引起小鼠關節(jié)生物力學的失衡，而整合素α5β1接收到這種失衡的力學信號后將β1亞基的表達下調，致使整合素調節(jié)細胞外基質與軟骨細胞的信號傳導能力減弱，最終導致軟骨細胞死亡及細胞外基質的損傷。這提示了膝關節(jié)軟骨承受過量的應力負荷將通過整合素調控導致KOA發(fā)病。

2.2 整合素α5β1調控細胞內的信息轉導

整合素α5β1參與細胞內信號轉導主要靠激活兩種絡氨酸依賴性通道而進行：黏著斑激酶（focaladhesion kinase，F(xiàn)AK）信號轉導通路和Shc信號通路。FAK通道可以進而激活FAK-Ras-絲裂素活化蛋白激酶（MAPK）通路、FAK-磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通路和FAK-轉錄因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）通路，少部分整合素可以激活SHc信號轉導通路［16-17］。

FAK作為一種酪氨酸激酶，可分三個結構域：N2端區(qū)、激酶區(qū)和C2端區(qū)。整合素與FN結合，促進黏著斑（focal adhesion plaque，F(xiàn)AP）的形成，β1亞基的胞質端與FAK的N2端區(qū)結合，引起FAK構象的改變，使激酶結構域處于活化狀態(tài)［18］。同時，F(xiàn)AK上的可磷酸化的絡氨酸位點Tyr397自身磷酸化，進而激活MAPK通路、FAK-磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通路和FAK-STAT1通路，對細胞內基因表達活性、細胞黏附力等產(chǎn)生影響［19］。

Zhang Y等［20］對12周齡SD大鼠的半月板軟骨細胞進行循環(huán)靜水壓力處理，結果發(fā)現(xiàn)處理后α5β1 mRNA和蛋白表達水平顯著上調，且磷酸化黏著斑激酶（Pho-FAK）表達上調，提示FAK通道的激活，并觀察到MAPK通路、PI3K通路產(chǎn)物Pho-PI3K、Pho-ERK1/2上調。半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，是細胞凋亡的過程中的重要物質。循環(huán)靜水壓處理后，同樣觀察到caspase-3下調。為論證磷酸化PI3K、磷酸化ERK1/2上調與caspase-3下調是否與整合素α5β1表達上調有關，研究者通過整合素α5β1抑制劑與特異性siRNA轉染抑制整合素α5β1的表達，發(fā)現(xiàn)這些效應均可被消除。提示隨著膝骨關節(jié)炎病情發(fā)生時，人體可能通過調控α5β1-FAK-PI3K/ERK的通路調節(jié)軟骨細胞凋亡使半月板軟骨細胞產(chǎn)生持續(xù)退變。

Birgit L等［21］對人體骨關節(jié)炎軟骨施加拉伸應力后觀測發(fā)現(xiàn)細胞外基質降解酶與白介素-6（IL-6）的含量顯著降低，而負責調控這兩者的α5β1-FAK-MAPK與 α5β1-FAK-STAT3通 路的磷酸化水平亦顯著降低。提示膝骨關節(jié)炎的發(fā)生與上述兩條通路的調控有關。

3 整合素α1β1參與調控KOA發(fā)病

3.1 整合素α1β1調控細胞外基質的信息轉導

整合素α1β1作為一種主要的膠原蛋白受體，可以與細胞外基質中含量90%的II型膠原、富含的VI型膠原結合［22］。膠原的降解、損壞往往被視作KOA軟骨損傷的病理基礎之一。席小芳等［23］為研究KOA軟骨細胞外基質Ⅱ型膠原的降解與整合素α1β1-盤狀結構域受體2（discoidin domain receptor，DDR2）-MMP13通路間的表達的關系，將新西蘭大白兔用Hulth-Telhag法制成KOA模型后，取其軟骨細胞觀測后發(fā)現(xiàn)模型組較之正常組的Ⅱ型膠原蛋白含量及活性表達均明顯減少，而DDR2、MMP13活性及mRNA表達均明顯增多。前文提到，MMP族系表達增加能夠加速細胞外基質纖維網(wǎng)狀結構的降解，而降解后的Ⅱ型膠原三螺旋結構裸露并與DDR2受體結合，促使DDR2發(fā)生酪氨酸磷酸化并啟動一系列生物化學反應和OA病理變化。因此其反應出KOA病理的發(fā)生與α1β1表達引發(fā)MMP13與DDR2水平上調引發(fā)Ⅱ型膠原纖維降解有很大關系。

在骨關節(jié)炎軟骨中，II型膠原經(jīng)MMP-13降解后會發(fā)生從II型膠原到I型膠原的轉換的現(xiàn)象［24-25］，在此背景下，Marie C R 等［26］為研究軟骨細胞單獨在Ⅰ型膠原纖維中是否有MMP13表達，將小鼠軟骨細胞系列615（MC615）放置在只充滿Ⅰ型膠原的培養(yǎng)皿中，觀測后發(fā)現(xiàn)的確有MMP13的表達上調，同時，為了進一步驗證整合素α1β1在MMP13與Ⅰ型膠原纖維之間的調控作用，加入了α1亞基與β1亞基的抗體，抑制了整合素功能后發(fā)現(xiàn)軟骨細胞形態(tài)比未加整合素抗體時更加完整，因此證實了整合素α1β1可以通過調控MMP13表達上調來使膠原類型改變，穩(wěn)定性降低，最終使軟骨受損，從而形成KOA發(fā)生的病理基礎。

3.2 整合素α1β1調控細胞內的信息轉導

生長因子（growth factor，GF）是一種存在于細胞中刺激細胞生長活性的細胞因子。其通過與特異性高親和性的細胞膜受體結合，調節(jié)細胞生長與其他細胞功能等效應的多肽類物質［27］。研究發(fā)現(xiàn)，整合素能夠經(jīng)細胞內調控不同的細胞因子表達來影響軟骨細胞的損傷與保護。

表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）是一種酪氨酸激酶受體，EGFR的抑制劑MIG-6能促進使EGFR受到抑制而引起自發(fā)性骨關節(jié)炎的早期發(fā)病［28］，但當EGFR過度表達后卻會導致更嚴重的骨關節(jié)炎［29］。轉移生長因 子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）被認為是一種參與組織損傷修復的生長因子。然而，TGF-β信號過度表達會導致小鼠膝關節(jié)軟骨細胞生長過度，大量消耗原料與能量，使蛋白多糖耗竭，最終反而引起軟骨損傷［30］。Sefat F等［30］為研究整合素α1β1是否對生長因子存在調控從而對創(chuàng)傷后骨關節(jié)炎產(chǎn)生保護作用，其通過觀測α1基因缺失小鼠（α1-Null）小鼠與野生型（WT）小鼠軟骨發(fā)現(xiàn)，在α1-null鼠中抑制EGFR信號能使其軟骨損傷減少，而WT小鼠則無此現(xiàn)象，因此證明了整合素α1β1能夠調控EGFR來使創(chuàng)傷后關節(jié)炎得到保護。同時他們還發(fā)現(xiàn)α1β1抑制TGF-β信號轉導，α1-null小鼠軟骨細胞鈣瞬變反應發(fā)生與Smad2/3（將TGF-β信號從細胞表面受體傳導至細胞核的過程中起到關鍵性作用的蛋白）活化使TGF-β閾值比WT小鼠低10倍。本實驗提示我們整合素α1β1能夠調控EGFR與TGF-β的信號來影響KOA發(fā)展的進程

Parekh R等［31］為研究整合素α1β1對小鼠骨關節(jié)炎軟骨中白介素-1（IL-1）和TGF-β1表達的影響，觀測α1-Null小鼠與野生型小鼠，發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠軟骨細胞相比，α1-Null小鼠細胞中IL-1R2mRNA表達的基礎水平降低，同時通過細胞內鈣瞬變反應與Smad2/3激活增強了TGF-β1的應答。白介素有IL-1α與IL-1β兩種亞型，與IL-1R1與IL-1R2兩種受體相對應。α1-Null小鼠細胞中IL-1R2mRNA下調提示整合素α1β1可以通過改變IL受體表達水平來影響軟骨細胞對IL-1的反應，進而影響骨關節(jié)炎進展。

另一些研究提示整合素α1β1可能通過其他信號通路調控KOA的發(fā)生。例如Mickiewicz B等［32］觀察α1-null小鼠與野生型小鼠，發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，α1-null小鼠血清中二甲基砜、谷氨酰胺、5-羥色胺的水平更高。而5-羥色胺參與TRP通道的炎癥介質調節(jié)，提示整合素α1β1可能與Trp通道家族成員之間存在相互作用從而影響KOA的炎癥發(fā)展。

4 總結與討論

整合素不僅家族龐大，存在于多種組織中，且參與的信號轉導過程亦十分復雜。整合素α1β1、α5β1與膝關節(jié)軟骨的關聯(lián)度緊密，在KOA發(fā)病機制中它們具有一定的地位。通過對α1β1、α5β1在調控細胞外基質及細胞內信號轉導的各實驗的歸納總結，能夠明確以下六點：（1）KOA的發(fā)生與α5亞基缺失或α5-FN結合受阻形成的軟骨損傷有關。（2）KOA的產(chǎn)生與過量的應力刺激信號經(jīng)α5β1轉導后引起的軟骨細胞死亡及細胞外基質損傷有關。（3）KOA的發(fā)生與進展可能與α5β1調控FAK-Ras-MAPK、FAK-PIK3、FAKSTAT以及SHc通路的信號轉導來影響軟骨細胞的存活、炎癥反應有關。（4）KOA的發(fā)病與α1β1調控下的Ⅱ型膠原降解引起的細胞外基質的損傷有關。（5）KOA的發(fā)病可能是由于α1β1調控細胞因子及生長因子的表達水平而引起的炎癥反應或細胞損傷、基質損傷有關。（6）KOA炎癥的發(fā)展可能與α1β1可能與Trp通道家族成員之間的相互作用有關。

從上述所有研究來看，目前KOA相關的整合素研究有以下特點：（1）實驗類型還是以動物實驗為主，小鼠與家兔軟骨是目前研究的主流對象。（2）對亞基的基因敲除/缺陷是主要的對整合素的干預方式。（3）細胞外基質的纖維蛋白、蛋白金屬酶、生長因子及細胞因子的含量或表達水平是實驗主要的評價指標。（4）實驗設計思路統(tǒng)一為經(jīng)典的“黑箱”式邏輯，即已知整合素能調控某一通路而使通路終點某產(chǎn)物產(chǎn)生變化，因此經(jīng)條件干預后的產(chǎn)物出現(xiàn)增加/減少或水平上調/下調則能論證整合素對此條通路的調控作用。

總體來講，目前研究整合素通路本身或軟骨中整合素通路的文獻較為紛繁，而以KOA疾病為核心來討論整合素調控的篇目相對來說較少，因此整合素與KOA發(fā)病機制間相關性的研究結論實際需要結合KOA病理基礎與整合素實驗的結果進行合理的邏輯推論。希望日后有以直接探索KOA發(fā)病機制與整合素間作用為目的的研究出現(xiàn)，或者有更多以KOA患者關節(jié)軟骨為研究對象的實驗誕生，相信對于整合素參與KOA發(fā)病機制的探索將更為深入與明確。