柳鴻敏，侯程程，楊顯達，吳東林，李 靜

(吉林省疾病預(yù)防控制中心，吉林 長春130062)

人腺病毒(Human Adenovirus,HAdV)屬于腺病毒科哺乳動物腺病毒屬雙鏈DNA病毒[1]。最早發(fā)現(xiàn)于1953年。人腺病毒(HAdVs)可以引起多種疾病，常見的如上呼吸道或下呼吸道感染[2]。急性呼吸道感染是兒童高發(fā)病和常見病，其中90%是由病毒感染引起的[3]，目前HAdV在5歲以下兒童中急性下呼吸道感染率約為5%～10%[4]，近年來兒童腺病毒感染有逐年提高的趨勢[5-6]。本研究對2018年6月至2021年6月因呼吸道感染就診的兒童進行呼吸道相關(guān)病毒檢測，對腺病毒陽性的標本進行病毒分離，基因序列測定并分析其流行特征，以了解長春市兒童感染腺病毒的情況，為臨床診斷和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象采集吉林大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒童呼吸科，2018年6月至2021年6月具有發(fā)熱、咳嗽等呼吸道感染癥狀的172例兒童患者支氣管肺泡灌洗液(bronchoalvcoar lavage fluid,BALF)標本。

1.2 標本采集采用電子支氣管鏡到達病變局部位進行灌洗，灌洗部位選擇病變重的肺段。0.9%氯化鈉溶液(體重≤20 kg每次灌洗1 ml/kg,體重>20 kg每次灌洗量1 ml/kg)進行支氣管肺泡灌洗，以負壓10～15 mmHg進行抽取以獲取BALF，將采集到的BALF放置于4℃冰箱。

1.3 實驗室檢測

1.3.1核酸提取與檢測 應(yīng)用MagNA Pure 96自動核酸提取儀，使用MagNA Pure DNA and ViralNA Small Volume Kit試劑盒，按照儀器及試劑盒說明進行操作提取核酸。采用Real-time PCR方法檢測流感病毒A、B型(Influenza virus,IFVA、IFVB)、副流感病毒(Parainfluenza virus,PIV)、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial,RSV)、腺病毒(Human Adenovirus,HAdV)、博卡病毒(Human bocavirus,HBoV)、人偏肺病毒(Human metapneumovirus,HMPV)、支原體(Mycoplasmal pneumonia,MP)、衣原體(Chlamydial pneumonia,CP)。

1.3.2病毒分離 ADV陽性標本使用青鏈霉素(終濃度青霉素G 100 U/mL，硫酸鏈霉素 100 μg/mL)進行處理后接種于人喉癌上細胞系(Human epidermoid larynx carcinoma cell line，Hep-2)細胞中，加入血清含量為2%的細胞維持液，置于35℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，每日觀察細胞病變，待細胞75%以上細胞出現(xiàn)細胞病變時收獲。若無病變，培養(yǎng)至7日將細胞培養(yǎng)液置于-70℃冰箱內(nèi)反復(fù)凍融后傳代，盲傳3代。

1.3.3腺病毒分型檢測 采用巢式PCR方法擴增HAdV六鄰體(Hexon)基因片段，具體序列如表1。

表1 引物序列

第1輪引物為AdhexF1和AdhexR1，第2輪引物為AdhexF2和AdhexR2，兩輪反應(yīng)條件相同均為94℃預(yù)變性2 min，94℃變性1 min，45℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環(huán)，72℃延伸5 min。理論擴增片段第一輪長度在764～896 bp，第2輪長度在688～821 bp。將所得的目的擴增片段送到上海生工生物工程有限公司進行基因序列測定。

1.3.4序列分析 將所有Hexon基因PCR陽性擴增產(chǎn)物送到上海生工生物技術(shù)有限公司進行序列測定。測序結(jié)果使用sequencer5.0軟件拼接后在GenBank上進行BLAST比較分析。

1.3.5進化分析 測序完成后，用 DNAStar 4.0 軟件對測得的序列進行編輯,并進行同源性分析，計算 Sequence Distances，再用 MEGA 7.0 軟件采用鄰位相臨法(NJ)繪制基因種系發(fā)生樹。

2 結(jié)果

2.1 基本情況

2018年6月至2021年6月在吉林大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒童呼吸科采集支氣管肺泡灌洗液172份，其中男性91人，女性81人，男女性別比為1.12∶1；年齡上分布0～1歲組16人(9.3%)，1～5歲組89人(51.74%)，5～15歲組67人(38.95%)。年齡最大為15歲，最小為0.33歲(4個月)。

2.2 病原檢測結(jié)果

172份標本中共檢出腺病毒陽性標本32份，陽性率為18.6%(32/172)。其中男性15人，女性17人，男女性別比為0.88∶1；年齡上分布0～1歲組5人(15.63%)，1～5歲組18人(56.25%)，5～15歲組9人(28.12%)。年齡最大為15歲，最小為1歲。

32份腺病毒陽性標本混合感染檢出情況：腺病毒單獨感染6例，占18.75%(6/32)；二重感染14例，占43.75%(14/32)；三重感染8例，占25%(8/32)；四重感染4例，占12.5%(4/32)。與支原體、流感病毒混合感染情況居多，見表2。

表2 下呼吸道標本病原檢測結(jié)果

2.3 腺病毒分型結(jié)果

32份腺病毒陽性標本進行處理后接種于Hep-2細胞，獲得腺病毒毒株13株。經(jīng)巢式PCR擴增Hexon基因產(chǎn)物后進行測序，序列進行BLAST比對，7型11株，2型1株，3型1株。

對11株7型腺病毒的Hexon基因部分序列進行同源性和進化分析，發(fā)現(xiàn)所分離得到的11株7型腺病毒與國內(nèi)上海、陜西、河北、深圳等地分離得到的毒株，同源性高達99.9%～100.0%(見圖1)。

圖1 腺病毒7型Hexon基因序列進化圖

對1株2型腺病毒的Hexon基因部分序列進行同源性和進化分析，發(fā)現(xiàn)所分離得到的1株2型腺病毒與國內(nèi)云南、西藏、陜西、河北、長春等地分離得到的毒株，同源性高達99.8%～100.0%(見圖2)。

圖2 腺病毒2型Hexon基因序列進化圖

對1株3型腺病毒的Hexon基因部分序列進行同源性和進化分析，發(fā)現(xiàn)所分離得到的1株3型腺病毒與國內(nèi)北京、長春、浙江、上海等地分離得到的毒株，同源性高達99.5%～100.0%(見圖3)。

圖3 腺病毒3型Hexon基因序列進化圖

3 討論

HAdV 在全球普遍流行，可引起呼吸道疾病、結(jié)膜炎、膀胱炎、胃腸炎和神經(jīng)性疾病等臨床疾病[7-11]，大多數(shù)感染是自限性的，臨床癥狀不明顯或僅引起輕度癥狀。但是少數(shù)型別可引起嚴重的、甚至是致命的感染，尤其在嬰幼兒、老年人和免疫系統(tǒng)缺陷人群。目前，國內(nèi)尚未有相關(guān)疫苗和特異性的治療藥物，因此，腺病毒常見型別的分型檢測顯得尤為重要。目前已經(jīng)鑒定至少103個型別，可分為7組，即A-G 型，其中，B 型(HAdV-3、7、11、14)、C型(HAdV - 1、2、5、6)和E 型(HAdV4)是引起呼吸道感染的主要病原體[12-13]。

本研究對2018-2021年長春市兒童下呼吸道標本進行腺病毒檢測，檢出率為18.6%，本省的HAdV優(yōu)勢流行株為7型。這一結(jié)果與上海徐匯區(qū)2012-2016年的檢出率18.68%相近[14]；1～5歲兒童腺病毒感染率為10.46%，較其他年齡組感染率高，與武漢市2012～2015年監(jiān)測結(jié)果2～5歲兒童腺病毒感染所占比例相似[15]。呼吸道腺病毒有較高的混合感染率[16]，本研究混合感染率為81.25%，與支原體、流感病毒混合感染情況居多。我國近十年不同地區(qū)主要呼吸道HAdV 型別的構(gòu)成比研究數(shù)據(jù)顯示，我國北部、西北部和南部省份的檢出占比較高[17]。相較于其他型別，HAdV-7感染患兒更易罹患重癥肺炎[18]。本研究對13株腺病毒毒株進行Hexon基因序列BLAST比對，其中7型11株，占84.61%，是長春市兒童下呼吸道腺病毒感染的主要型別。近幾年，我國頻繁出現(xiàn)HAdV-7引起的聚集性爆發(fā)疫情，經(jīng)常發(fā)生在學(xué)校和部隊。2015 年某院校集中出現(xiàn)聚集性發(fā)熱伴呼吸道癥狀患者，經(jīng)采集鼻咽拭子進行PCR 檢測為腺病毒B 組7 型陽性[19]。2019 年某部士官學(xué)校學(xué)員崗前培訓(xùn)期間，出現(xiàn)聚集性發(fā)熱伴呼吸道癥狀病例，發(fā)病率高達35.14%，經(jīng)實驗室檢測確診為腺病毒B 組7 型陽性[20]。2018年安徽省安慶市某部隊發(fā)生了1起急性呼吸道疾病的聚集性疫情，共13人發(fā)病，經(jīng)證實這是一起腺病毒7型引起的聚集性疫情[21]。

近些年我國各地呼吸道HAdV 傳染病暴發(fā)疫情不斷出現(xiàn)，對本省HAdV 監(jiān)測結(jié)果進行實時分析，可以提升HAdV 暴發(fā)疫情的早期應(yīng)急處置能力，及時有效控制并阻斷疫情播散，提出更有針對性的有效措施。