王 夢，陳 芳，萬 玉，柏中喜

心血管疾病是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)病人發(fā)病和死亡的主要原因[1]。CKD中的血管疾病涉及動脈壁的內(nèi)膜層損傷、內(nèi)皮功能障礙和脂質代謝障礙，中間層的損傷涉及礦物質代謝紊亂并導致血管鈣化，這些因素會導致動脈粥樣硬化[2]。此外，這兩種血管疾病有一些共同的病因，如炎癥、尿毒癥毒素和氧化應激。CKD病人的心血管死亡率與內(nèi)側血管鈣化相關。血管鈣化在CKD早期發(fā)展，并在疾病晚期逐漸增加[3]。血管鈣化是CKD礦物質骨病的一部分，與高磷血癥有關，是血管鈣化和心血管死亡的危險因素，尤其在CKD病人中[4]。因此，磷酸鹽被認為是一種血管鈣化發(fā)展的關鍵因素。血管鈣化被認為是一個活躍的過程，主要由血管平滑肌細胞調(diào)節(jié)[5]。在高磷刺激期間，血管平滑肌細胞分化為具有成骨/成軟骨細胞表型的細胞。血管鈣化是一種機制復雜的生物調(diào)節(jié)過程，可由腫瘤壞死因子α誘導蛋白3(TNFAIP3)/核轉錄因子-κB(NF-κB)/半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)/白細胞介素-1β(IL-1β)信號通路介導[6]。據(jù)報道，TNFAIP3表達的上調(diào)對抗鈣化作用至關重要。TNFAIP3是NF-κB的靶基因，反過來通過負反饋機制抑制NF-κB活性[7]。定期有氧運動被廣泛認為是降低心血管疾病風險的有效方法，最近世界衛(wèi)生組織建議成年人每周至少進行150 min的有氧運動，以減少心血管疾病的風險[8]。有氧運動被證明可以減少炎癥并改善CKD病人的血管內(nèi)皮功能和動脈僵硬度/順應性。先前的研究表明，有氧運動可以有效改善CKD病人的心肺功能和健康相關生活質量[9]。盡管運動訓練可能是一個有前景的解決方案，但有氧運動訓練對CKD病人的影響尚未完全闡明。因此，本研究探討有氧運動通過TNFAIP3介導的NF-κB抑制磷酸誘導的血管鈣化的實驗研究。

1 材料與方法

1.1 實驗小鼠 選取50只12周齡C57Bl/6小鼠，體質量(18±4)g，購自南京博恩生物技術有限公司。將小鼠置于標準無特定病原體環(huán)境：室內(nèi)恒溫24 ℃，空氣相對濕度60%，給予光照/黑暗循環(huán)(12 h光照、12 h黑暗交替)，飼養(yǎng)期間可隨意獲取食物和自來水。所有動物實驗均按照美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物護理進行，并獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 實驗分組 將小鼠分為對照組、模型組、有氧運動組，每組15只。對照組小鼠未進行腎切除術，接受標準嚙齒動物飲食；模型組通過腎切除術和高磷酸鹽飲食誘導小鼠CKD和血管鈣化；有氧運動組小鼠在成功誘導CKD和血管鈣化后，在跑步機上進行有氧運動，持續(xù)8周。

1.3 CKD模型建立 實驗小鼠進行右腎次全腎切除術，進行左腎切除術。從外科手術中恢復后，飲食改為富含磷酸鹽的飲食(0.6%鈣、0.9%磷)，持續(xù)6周。通過光度法(FUJI FDC 3500i/4000i，Sysmex)測量模型小鼠血漿尿素氮(BUN)、磷酸鹽和鈣濃度，未進行腎切除術的對照小鼠接受標準嚙齒動物飲食。實驗結束后，通過眶后穿刺收集血液。在吸入異氟醚麻醉下通過頸椎脫臼處死小鼠，快速收集主動脈組織并速凍。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠有氧運動 對于有氧運動，小鼠從外科手術中恢復后在跑步機(哥倫布儀器exer-3/6/小鼠平板跑步機)上適應1周，并進行為期8 周的鍛煉方案，期間沒有傾斜或電擊刺激。運動速度從每周 12.5 m/min增加到 18.5 m/min，每天運動時間從 30 min增加到50 min。由于小鼠之間的運動能力略有不同，因此，記錄每只小鼠的每日跑步距離，并將總跑步距離用作運動能力的衡量標準。

1.4.2 實時定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR) 根據(jù)制造商的說明，使用 Trifast 試劑(Peqlab)從小鼠主動脈組織中分離總 RNA。使用 oligo(dT)12-18 引物(賽默飛世爾科技) 和SuperScriptⅢ逆轉錄酶(賽默飛世爾科技) 對 2 μg RNA 進行逆轉錄。根據(jù)制造商的說明，使用 iCycler iQTM 實時聚合酶鏈式反應(PCR)檢測系統(tǒng)(生物放射實驗室)和 iQTM Sybr Green Supermix(生物放射實驗室)進行RT-PCR。PCR 產(chǎn)物的特異性通過熔解曲線分析得到證實。所有 PCR 均一式兩份進行，相對 mRNA 倍數(shù)變化通過 2-ΔΔCt方法使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參。通過RT-PCR檢測小鼠主動脈成骨標志物、炎性因子mRNA表達，主動脈成骨標志物包括msh同源框2(MSX2)、核心結合因子α-1(CBFA1)和組織非特異性堿性磷酸酶(ALPL)；炎性因子包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-1β、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-18(IL-18)。

1.4.3 蛋白質印跡分析 將小鼠主動脈組織用冰冷的免疫沉淀(IP)裂解緩沖液(賽默飛世爾科技)裂解，并輔以完整的蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物(賽默飛世爾科技)。在 10 000 r/min 離心 5 min后，將蛋白質在 Roti-Load1 緩沖液中于10 ℃下煮沸 10 min。在十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠上分離等量的蛋白質并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將膜與一抗在 4 ℃下孵育過夜：小鼠抗 A20辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)(稀釋1∶1 000，sc-166692，圣克魯斯生物技術公司)，山羊抗NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NLRP3)(1∶1 000，Abcam，USA)，兔抗磷酸化核因子κB抑制蛋白α(IκBα)(Ser32，稀釋 1∶1 000，#2859，Cell Signaling)，兔抗核因子κB抑制蛋白α(IκBα，稀釋 1∶1 000，#4814，Cell Signaling)，兔抗NF-κB p65(稀釋 1∶1 000，#8242，Cell Signaling)，人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP2，1∶1 000，Abcam，USA)，Caspase-1(1∶1 000，Abcam)，或兔抗GAPDH 抗體(1∶5 000 稀釋，#2118，Cell Signaling)，使用二級抗山羊HRP偶聯(lián)抗體(1∶5 000 稀釋，圣克魯斯生物技術公司)或抗兔 HRP 偶聯(lián)抗體(1∶1 000 稀釋)，Cell Signaling) 在室溫下保持 1 h。對于上樣對照，將膜在室溫下在剝離緩沖液(賽默飛世爾科技)中剝離10 min。用增強化學發(fā)光法(ECL)用試劑(賽默飛世爾科技)檢測抗體。通過使用 Image J軟件對條帶進行量化。通過蛋白印跡和RT-PCR檢測小鼠動脈組織中TNFAIP3的mRNA和蛋白表達；通過蛋白印跡檢測小鼠主動脈中磷酸化IκBα(p-IκBα)、NF-κB p65蛋白表達以及主動脈中血管鈣化、炎癥小體相關蛋白BMP2、NLRP3和Caspase-1表達。

1.4.4 血管鈣化的定量 細胞和主動脈的鈣沉積通過鈣含量檢測試劑盒(Leagene，北京，中國)進行定量。對于細胞培養(yǎng)，去除培養(yǎng)基并用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌后收集血管平滑肌細胞(VSMC)。對于主動脈，將主動脈切成約 1mm3的碎片。主動脈以3 000×g離心 3 min。上清液用于檢測鈣含量。在酶標儀(VARIOSKAN LUX，美國熱科學公司)上在 610 nm 處測定吸光度。蛋白質濃度通過 BCATM蛋白質測定法(Pierce，美國)定量。鈣含量通過蛋白質濃度標準化。

1.4.5 茜素紅染色 茜素紅染色用于動脈鈣化，用PBS洗滌主動脈以去除血液并在95%乙醇溶液中浸泡過夜。將主動脈與溶解在 1% KOH 中的 0.004% 茜素紅孵育過夜，用 2% KOH 洗滌2次。對于主動脈的paraffin部分，主動脈段固定在4%多聚甲醛中并嵌入paraffin中。主動脈樣本被切成 6 μm 厚。切片脫蠟，0.2%茜素紅染色5 min，去離子水洗滌。將切片依次在無水丙酮溶液中浸泡30 s，無水二甲苯浸泡1 min。

2 結 果

2.1 3組TNFAIP3表達比較 模型組TNFAIP3的mRNA和蛋白表達較對照組降低(P<0.05)，有氧運動組TNFAIP3的mRNA和蛋白表達較模型組升高(P<0.05)。詳見表1。

表1 3組TNFAIP3表達比較(±s)

2.2 3組小鼠主動脈中p-IκBα和NF-κB p65蛋白表達比較 模型組p-IκBα和NF-κB p65蛋白表達較對照組升高(P<0.05)，有氧運動組p-IκBα和NF-κB p65蛋白表達較模型組降低(P<0.05)，提示有氧運動降低小鼠NF-κB磷酸化和蛋白的表達。詳見圖1及表2。

圖1 蛋白印跡法檢測p-IκBα和NF-κB p65蛋白表達

表2 3組小鼠主動脈中p-IκBα和NF-κB p65蛋白表達比較(±s)

2.3 3組主動脈成骨標志物mRNA表達比較 模型組MSX2、CBFA1和ALPL的mRNA表達較對照組升高(P<0.05)，有氧運動組MSX2、CBFA1和ALPL的mRNA表達較模型組降低(P<0.05)，提示有氧運動可降低主動脈成骨標志物mRNA表達。詳見表3。

表3 3組主動脈成骨標志物mRNA表達比較(±s)

2.4 3組BMP2、NLRP3和Caspase-1蛋白表達比較 模型組BMP2、NLRP3和Caspase-1蛋白表達較對照組升高(P<0.05)，有氧運動組BMP2、NLRP3和Caspase-1蛋白表達較模型組降低(P<0.05)，提示有氧運動可抑制血管鈣化和炎癥小體相關蛋白的表達。詳見表4。

表4 3組BMP2、NLRP3和Caspase-1蛋白表達比較(±s)

2.5 3組主動脈鈣含量比較 通過鈣含量檢測試劑盒檢測小鼠主動脈中的鈣含量，模型組鈣含量較對照組升高(P<0.05)，有氧運動組鈣含量較模型組降低(P<0.05)。主動脈切片茜素紅染色顯示，與對照組相比，模型組出現(xiàn)嚴重的血管鈣化，而有氧運動組抑制礦物質沉積，血管鈣化較模型組減輕(P<0.05)。詳見圖2、表5。

圖23 組小鼠主動脈茜素紅染色結果

表5 3組主動脈鈣含量比較(±s) 單位：μg/mg

2.6 有氧運動抑制血管鈣化 模型組TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18 mRNA表達較對照組升高(P<0.05)，有氧運動組TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18 mRNA表達較模型組降低(P<0.05)，提示有氧運動可降低小鼠體內(nèi)炎性因子表達。詳見表6。

表6 3組炎性因子的mRNA表達比較(±s)

3 討 論

CKD是一個全球性的公共衛(wèi)生問題。成人CKD的身體素質逐漸降低，主要原因是腎性貧血和骨骼肌疾病[10]。有氧運動訓練是應用最廣泛的項目，定期鍛煉可改善CKD病人的心肺功能、力量和身體功能。據(jù)報道，在血壓正常和高血壓受試者中，有氧訓練可以降低靜息血壓，尤其是在高血壓受試者中[11]。透析的CKD病人的發(fā)病率和死亡率風險增加，部分原因是與身體機能下降有關。幾項針對CKD的研究表明，有氧運動對身體機能和健康有益。炎癥是血管鈣化的促進劑，不僅會引起血管平滑肌細胞損傷，還會導致肝臟分泌胎球蛋白A減少[12]。其他研究表明，有氧運動訓練可以降低非透析依賴性CKD病人的血漿C反應蛋白(CRP)和IL-6水平。

本研究結果表明，主動脈血管鈣化的小鼠在進行漸進式有氧運動后，其血管鈣化程度顯著降低。平滑肌細胞能夠在病理條件下改變其表型并釋放基質囊泡并啟動動脈礦化，其過程類似于生理性骨礦化。在高磷酸鹽刺激期間，平滑肌細胞分化為具有成骨/成軟骨細胞表型的細胞。表型轉分化的特征在于成骨轉錄因子的表達，如MSX2和CBFA1。成骨/成軟骨細胞表達ALPL，它水解內(nèi)源性鈣化抑制劑焦磷酸鹽，從而促進磷酸鈣晶體不受控制的形成[13]。平滑肌細胞的表型轉分化受復雜的信號通路調(diào)節(jié)，與全身炎癥有關，并且至少部分依賴于轉錄因子NF-κB，已成為血管鈣化的關鍵調(diào)節(jié)因子[14]。這項研究表明，在動物模型中，有氧運動在血管鈣化期間提供了強大的保護作用，改善小鼠血管平滑肌細胞的骨/軟骨形成作用。有氧運動增加TNFAIP3表達，抑制高磷血癥期間NF-κB的活化。轉錄因子NF-κB已成為血管平滑肌細胞軟骨形成分化的關鍵調(diào)節(jié)因子。NF-κB激活導致MSX2依賴性ALPL表達，CBFA1上調(diào)并干擾平滑肌細胞中的抗鈣化途徑。有氧運動能夠改變NF-κB活性。TNFAIP3表達上調(diào)對介導有氧運動的抗鈣化作用至關重要[15]。TNFAIP3是NF-κB的靶基因，反過來通過負反饋機制抑制NF-κB活性。研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠高磷酸鹽飲食增加的IκBα磷酸化，而這些通過后期有氧運動逆轉。因此，通過上調(diào)TNFAIP3抑制NF-κB可能是有氧運動在鈣化中的保護作用的基礎。

本研究表明，有氧運動可能通過影響NLRP3/Caspase-1和NF-κB通路來抑制體內(nèi)炎癥，從而減輕血管鈣化，有氧運動抑制血管平滑肌細胞中鈣沉積BMP2的表達。BMP2是平滑肌細胞成骨分化的關鍵標志物。血管鈣化與肝臟和腎臟等多個器官有關，現(xiàn)在被認為是一種類似于成骨的活躍基因調(diào)節(jié)過程[16]。血管鈣化最明顯的病理特征是主動脈中的礦物質沉積。其他病理特征包括主動脈彈性蛋白損傷和斷裂引起的管腔面積擴大和主動脈周長延長[17]。使用茜素紅染色的主動脈旁切面進一步證實了這一結果。鈣含量的定量分析也顯示有氧運動對血管鈣化的抑制作用。結果顯示，有氧運動可能通過調(diào)節(jié)NLRP3/Caspase-1/IL-1β和NF-κB通路抑制炎癥。據(jù)報道，在CKD病人中發(fā)現(xiàn)了嚴重的局部血管炎癥和全身炎癥[18]。在沒有可見礦物質沉積的情況下甚至可以看到局部血管炎癥并且血管鈣化開始于局部血管炎癥區(qū)域，這表明局部血管炎癥的發(fā)生早于血管鈣化[19]。血管炎癥會誘導主動脈中的鈣沉積，而鈣沉積又通過誘導促炎細胞因子(如IL-1β和TNF-α)的表達來促進炎癥反應，導致惡性循環(huán)，加重血管鈣化[20]。本研究結果顯示，接受腎次全切除術的小鼠在高磷酸飲食后誘導了IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的表達，其中IL-1β表達最為明顯，有氧運動顯著下調(diào)上述促炎細胞因子的表達。本研究結果還顯示，有氧運動對血管鈣化具有強大的抗炎作用。由于NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路介導炎癥，本研究探討了有氧運動在血管炎癥期間對該通路的影響。在血管炎癥過程中，NLRP3炎癥小體被激活，激活Caspase-1，隨后誘導IL-1β的產(chǎn)生，最終誘導血管炎癥的發(fā)生。

綜上所述，有氧運動通過上調(diào)TNFAIP的表達介導NF-κB磷酸化抑制，并阻礙NLRP3/Caspase-1/IL-1β信號通路的激活來抑制血管炎癥，從而防止血管鈣化。有氧運動在臨床上治療血管鈣化具有很大潛力，可以減少CKD病人血管鈣化和心血管疾病的進展。