趙楊靜，孫梓暄，嚴(yán)永敏，張 徐，錢 暉

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 200031）

臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)是利用分子生物學(xué)技術(shù)研究人體生物大分子（核酸和蛋白）的存在、結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)控的改變，從而為疾病的預(yù)測(cè)、預(yù)防、診治和轉(zhuǎn)歸提供分子水平信息的一門(mén)學(xué)科[1]。作為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)的主干課程，臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)由“理論知識(shí)”“檢測(cè)技術(shù)”“臨床應(yīng)用”3個(gè)篇章組成。“理論知識(shí)”篇涉及分子生物學(xué)基本知識(shí)、分子標(biāo)志物和標(biāo)本處理，“檢測(cè)技術(shù)”篇涉及眾多重要的分子檢測(cè)技術(shù)，“臨床應(yīng)用”篇涉及各類疾病常用的檢測(cè)技術(shù)和方法，其中“檢測(cè)技術(shù)”篇因各種技術(shù)的概念和原理較為復(fù)雜抽象，成為整門(mén)課程教學(xué)的重點(diǎn)、難點(diǎn)。教師需要合理進(jìn)行教學(xué)設(shè)計(jì)，將各種檢測(cè)技術(shù)概念和原理巧妙地與分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論及其臨床應(yīng)用相結(jié)合，才能收到最佳教學(xué)效果。本文以臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)課程中廣泛應(yīng)用的重要技術(shù)——實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（realtime quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）為例，進(jìn)行臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)，包括課程導(dǎo)入、知識(shí)講授、應(yīng)用拓展和課堂小結(jié)4個(gè)步驟，旨在引導(dǎo)學(xué)生提出問(wèn)題、解決問(wèn)題、聯(lián)系實(shí)際和發(fā)散思維（見(jiàn)表1）。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR“四步法”教學(xué)設(shè)計(jì)

1 以“新冠肺炎疫情”進(jìn)行課程導(dǎo)入

課程導(dǎo)入是教學(xué)設(shè)計(jì)的第一步，是每節(jié)課課堂教學(xué)的前奏，合理、新穎、貼近生活的課程導(dǎo)入能達(dá)到激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣、調(diào)動(dòng)學(xué)習(xí)積極性和引導(dǎo)主動(dòng)思考的目的和效果。2019年底發(fā)生的新冠肺炎疫情肆虐全球，目前已成為全球性重大公共衛(wèi)生事件。根據(jù)我國(guó)《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第九版）》，新冠病毒實(shí)驗(yàn)室檢查包括一般檢查、病原學(xué)及血清學(xué)檢查、影像學(xué)檢查。新冠病毒診斷方法包括基于分子診斷技術(shù)的核酸檢測(cè)和免疫技術(shù)的抗體檢測(cè)，其中新冠病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性為確診的首要標(biāo)準(zhǔn)，包括qPCR、基因測(cè)序和數(shù)字PCR等。但由于基因測(cè)序和數(shù)字PCR對(duì)儀器和檢測(cè)人員要求較高，不適用于大規(guī)模檢測(cè)，qPCR是目前臨床上對(duì)新冠病毒檢測(cè)的主要方法。相對(duì)于常規(guī)PCR技術(shù)，qPCR可在全封閉的體系中完成擴(kuò)增并進(jìn)行實(shí)時(shí)分析，定量檢測(cè)出低拷貝數(shù)的病毒RNA，具有快速、準(zhǔn)確、成本低等優(yōu)勢(shì)。在已上市的分子體外診斷試劑中，基于qPCR的新冠病毒核酸檢測(cè)盒占比超過(guò)70%[2]。在新冠病毒肺炎疫情出現(xiàn)之前，qPCR在臨床主要應(yīng)用于乙肝、丙肝和人乳頭瘤病毒等核酸檢測(cè)項(xiàng)目。而目前qPCR已成為新冠病毒全民核酸篩查和病例確診的主要手段，因此利用學(xué)生親身經(jīng)歷的新冠病毒核酸篩查為切入點(diǎn)，能激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)qPCR技術(shù)的興趣。

在教學(xué)過(guò)程中首先引導(dǎo)學(xué)生回憶“理論知識(shí)”篇已經(jīng)學(xué)過(guò)的標(biāo)本檢測(cè)前處理相關(guān)內(nèi)容，提出第一個(gè)問(wèn)題：“在進(jìn)行新冠病毒核酸樣本采集時(shí)，醫(yī)護(hù)人員會(huì)用一根長(zhǎng)棉簽采集鼻/咽拭子等，然后樣本會(huì)被送到醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行檢測(cè)，已知SARS-CoV-2是一種正義單鏈RNA病毒，檢驗(yàn)人員從患者樣本中分離純化出RNA之后，首選檢測(cè)方法是什么？”學(xué)生通過(guò)前面常規(guī)PCR技術(shù)部分的學(xué)習(xí)，一般能給出正確答案——qPCR。其次提出第二個(gè)問(wèn)題：“由于RNA不穩(wěn)定易降解，在進(jìn)行qPCR之前應(yīng)進(jìn)行何種反應(yīng)生成qPCR擴(kuò)增模板？”引導(dǎo)學(xué)回顧常規(guī)PCR相關(guān)內(nèi)容作為本次課程的知識(shí)儲(chǔ)備。最后提出問(wèn)題“qPCR的反應(yīng)體系和程序是什么？檢驗(yàn)人員是如何得出核酸檢測(cè)陰性或陽(yáng)性結(jié)果的？qPCR在感染性疾病檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)有哪些？”通過(guò)這3個(gè)環(huán)環(huán)相扣的問(wèn)題，讓學(xué)生認(rèn)識(shí)到qPCR技術(shù)的重要性。

2 以思維導(dǎo)圖進(jìn)行知識(shí)講授

思維導(dǎo)圖是20世紀(jì)70年代由英國(guó)心理學(xué)家東尼·博贊提出的，用于記憶、學(xué)習(xí)和思考的思維“地圖”。它作為一種高效的知識(shí)整理工具，能將煩瑣復(fù)雜的知識(shí)點(diǎn)以圖文并重的方式形象化、層級(jí)化地表現(xiàn)出來(lái)，具有思維可視化、思維激發(fā)和思維整理3個(gè)重要的特征，目前已經(jīng)被應(yīng)用到各個(gè)學(xué)科的教學(xué)中，并收到較好的應(yīng)用效果[3]。臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)課程中含有大量抽象概念和對(duì)比內(nèi)容，需要學(xué)生善于將腦海中零碎的知識(shí)點(diǎn)前后聯(lián)系，因此思維導(dǎo)圖適合運(yùn)用到本課程教學(xué)中，幫助學(xué)生建立清晰的邏輯層次和立體化的知識(shí)框架。

通過(guò)前期核酸體外擴(kuò)增技術(shù)的學(xué)習(xí)，學(xué)生已經(jīng)掌握了常規(guī)PCR技術(shù)的基本原理、反應(yīng)體系和擴(kuò)增參數(shù)，因此在進(jìn)行qPCR講授時(shí)，教師應(yīng)側(cè)重于講解其與常規(guī)PCR技術(shù)的差異。熒光定量PCR是在PCR體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)程，最后通過(guò)相關(guān)數(shù)據(jù)分析對(duì)目的基因進(jìn)行定量的技術(shù)。相對(duì)于常規(guī)PCR，qPCR技術(shù)的關(guān)鍵在于引入熒光基團(tuán)以及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR進(jìn)程并獲得待檢樣本中初始核酸拷貝數(shù)。教師在授課過(guò)程中要善于邊講解邊繪制思維導(dǎo)圖，先確定主題是“實(shí)時(shí)熒光定量PCR”，從主題展開(kāi)第一級(jí)主干分支，包括4個(gè)模塊“常用概念”“熒光物質(zhì)”“反應(yīng)體系”和“數(shù)據(jù)分析”，再逐級(jí)延伸。在繪制思維導(dǎo)圖時(shí)，教師要利用關(guān)鍵詞簡(jiǎn)明扼要地代表分支內(nèi)容，利用不同顏色的字體或線條突出重、難點(diǎn)，利用符號(hào)進(jìn)行知識(shí)點(diǎn)的聯(lián)系和對(duì)比，從而將抽象概念形象化。教師課堂中繪制思維導(dǎo)圖的目的在于帶領(lǐng)學(xué)生提綱挈領(lǐng)地學(xué)習(xí)，讓學(xué)生既見(jiàn)樹(shù)木又見(jiàn)森林，但不建議包含過(guò)多細(xì)節(jié)內(nèi)容，可在課后將思維導(dǎo)圖分享給學(xué)生，布置課后作業(yè)，要求學(xué)生將本次課程思維導(dǎo)圖各層級(jí)的細(xì)節(jié)分支補(bǔ)充完整，即可得到本次課程的完整知識(shí)體系。例如，教師可在課堂中繪制思維導(dǎo)圖（見(jiàn)圖1），要求學(xué)生課后結(jié)合課程所講內(nèi)容，查閱相關(guān)資料，將“常用概念”中每個(gè)概念的具體定義、“熒光物質(zhì)”中兩種方法的異同點(diǎn)、“反應(yīng)體系”中與常規(guī)PCR的異同點(diǎn)、“數(shù)據(jù)分析”中兩種分析方法的異同點(diǎn)補(bǔ)充完整。通過(guò)在教師的引導(dǎo)下繪制思維導(dǎo)圖，學(xué)生不僅能牢牢掌握本次課程的重、難點(diǎn)內(nèi)容，主次分明地梳理知識(shí)點(diǎn)，還能完成一次效果明顯的邏輯思維訓(xùn)練。因此，高校教師在課堂上使用思維導(dǎo)圖輔助知識(shí)講授，不僅能幫助學(xué)生輕松掌握知識(shí)間的層次關(guān)系，提高課堂授課效率，還能促進(jìn)學(xué)生課后鞏固復(fù)習(xí)，理解和記憶知識(shí)。

3 以“新冠病毒核酸檢測(cè)”為例進(jìn)行應(yīng)用拓展

臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)是利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行臨床輔助診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的學(xué)科，學(xué)生在扎實(shí)掌握各類實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理和步驟的基礎(chǔ)上，全面學(xué)習(xí)各分子檢驗(yàn)技術(shù)在臨床疾病中的實(shí)際應(yīng)用顯得尤為重要[4]。這就要求教師在講解完分子診斷技術(shù)理論知識(shí)的基礎(chǔ)上，結(jié)合其臨床應(yīng)用提高學(xué)生對(duì)技術(shù)應(yīng)用的認(rèn)識(shí)。目前我國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)了眾多國(guó)內(nèi)公司生產(chǎn)的基于qPCR法的新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒，教師可以新冠病毒核酸檢測(cè)作為qPCR的臨床應(yīng)用案例。在臨床應(yīng)用拓展部分，教師需要重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)qPCR進(jìn)行新冠病毒核酸檢測(cè)時(shí)技術(shù)應(yīng)用設(shè)置的參數(shù)或步驟的特別之處。例如，利用qPCR對(duì)RNA定量檢測(cè)前，首先要將生物樣本中分離得到的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR成cDNA，才能作為qPCR模板。但由于新冠病毒具有生物危害性，且需要盡可能縮短檢測(cè)時(shí)間，因此采用的是一步法逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR，即將逆轉(zhuǎn)錄和TaqMan探針?lè)╭PCR兩步反應(yīng)集中在一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行。其次，根據(jù)SARSCoV-2全基因組序列，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)推薦新冠病毒的3個(gè)特異性保守區(qū)域（ORF1ab、N和E基因）適合作為擴(kuò)增區(qū)域，目前大部分試劑盒以O(shè)RF1ab和N雙基因作為擴(kuò)增靶標(biāo)設(shè)計(jì)探針和引物。最后，結(jié)合擴(kuò)增曲線和循環(huán)閾值進(jìn)行結(jié)果判斷，判斷擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性、陰性或可疑[5]。針對(duì)臨床應(yīng)用拓展，教師可給學(xué)生布置課外思考題，引導(dǎo)學(xué)生課后自主拓展學(xué)習(xí)，培養(yǎng)創(chuàng)新精神。例如：（1）一步法逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR是如何實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄和qPCR兩個(gè)反應(yīng)分步進(jìn)行？（2）目前新冠病毒在全球范圍持續(xù)出現(xiàn)了多種變異株，現(xiàn)用的探針和引物是否仍適用于檢測(cè)變異株？（3）新冠病毒探針和引物如何設(shè)計(jì)？（4）不同試劑盒采用不同序列的探針和引物是否會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果？（5）任何診斷指標(biāo)都有兩個(gè)基本評(píng)價(jià)指標(biāo)，即敏感性和特異性，全員或區(qū)域大規(guī)模新冠篩查采用混采方法會(huì)不會(huì)影響檢測(cè)的敏感性和特異性呢？此外，學(xué)生還可自主學(xué)習(xí)臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)線上學(xué)習(xí)資源，例如，登錄中國(guó)大學(xué)慕課平臺(tái)，學(xué)習(xí)江蘇大學(xué)開(kāi)設(shè)的臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)?zāi)秸n[6]，完成配套單元作業(yè)和單元測(cè)驗(yàn)，在互動(dòng)區(qū)與授課教師進(jìn)行交流討論。教師還要鼓勵(lì)學(xué)生利用課后時(shí)間廣泛查閱資料、研讀科學(xué)文獻(xiàn)，掌握國(guó)內(nèi)外相關(guān)最新應(yīng)用和研究進(jìn)展，培養(yǎng)科研思維和創(chuàng)新性思維。

4 以“抗疫精神”思政元素進(jìn)行課堂小結(jié)

高校肩負(fù)著培養(yǎng)國(guó)家棟梁的重要任務(wù)，是培養(yǎng)人才的主陣地，課程思政是當(dāng)前高校落實(shí)“立德樹(shù)人”根本任務(wù)的重要形式，這就要求高校教師積極思考和探索各學(xué)科專業(yè)課程中蘊(yùn)含的思政教育資源，制訂全新的教學(xué)計(jì)劃，將專業(yè)課程和思政課程同向同行、協(xié)同進(jìn)行。教師要善于在教學(xué)過(guò)程中深入挖掘課程思政元素，有機(jī)融入課程教學(xué)，達(dá)到潤(rùn)物無(wú)聲的育人效果。在此次抗擊新冠肺炎疫情過(guò)程中，“中國(guó)速度”和“中國(guó)經(jīng)驗(yàn)”獲得國(guó)際社會(huì)高度肯定。臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)課程中涉及的生物樣本采集、核酸提取和核酸檢測(cè)等內(nèi)容，涵蓋了很多生動(dòng)的思政元素[7]。例如，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)新冠病毒核酸依賴于病毒全基因組序列信息來(lái)設(shè)計(jì)探針和引物，中國(guó)第一時(shí)間向世界分享了新冠病毒全基因組序列信息和核酸檢測(cè)的探針引物序列[8]。新冠肺炎疫情發(fā)生以來(lái)，快速準(zhǔn)確的新冠病毒核酸檢測(cè)離不開(kāi)大量一線抗疫的醫(yī)護(hù)人員日夜奮戰(zhàn)。此外，近年來(lái)我國(guó)各類核酸檢測(cè)試劑出口海外、醫(yī)護(hù)人員參與全球抗疫援助等，都體現(xiàn)了中華兒女創(chuàng)新攻堅(jiān)的科學(xué)精神、矢志不渝的愛(ài)國(guó)主義精神、人民至上的奉獻(xiàn)精神和命運(yùn)與共的仁愛(ài)精神。

5 結(jié)語(yǔ)

相對(duì)于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)其他專業(yè)課程，臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)是一門(mén)相對(duì)較新的主干課程，是利用分子生物學(xué)理論和技術(shù)輔助疾病診療的學(xué)科，其理論知識(shí)微觀抽象、復(fù)雜難懂，容易讓學(xué)生對(duì)這門(mén)課產(chǎn)生畏懼感。這就要求教師對(duì)課程教學(xué)進(jìn)行精心設(shè)計(jì)，這樣才能收到理想的教學(xué)效果。核酸檢測(cè)技術(shù)作為臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)課程中的重要內(nèi)容，不僅是當(dāng)今新冠病毒核酸篩查和確診的主要手段，也為其他傳染性疾病、腫瘤、遺傳性疾病等提供臨床診斷依據(jù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)知識(shí)難度適中、應(yīng)用性強(qiáng)，易于應(yīng)用多媒體教學(xué)等多種教學(xué)方法，也易于結(jié)合社會(huì)熱點(diǎn)和融入課程思政，是臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)這門(mén)課程教學(xué)設(shè)計(jì)的理想范例。因此，在進(jìn)行臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)這門(mén)課程教學(xué)設(shè)計(jì)時(shí)，教師要以一節(jié)課為單位進(jìn)行教學(xué)設(shè)計(jì)，從課程導(dǎo)入、知識(shí)講授、應(yīng)用拓展、課堂小結(jié)4個(gè)步驟精心編排。以貼近學(xué)生生活的案例和問(wèn)題導(dǎo)入課程主題，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和提高其自主思考能力；以思維導(dǎo)圖的方式培養(yǎng)學(xué)生將零碎繁多的知識(shí)點(diǎn)進(jìn)行模塊化總結(jié)、建立邏輯層次、構(gòu)建知識(shí)體系的能力；以最典型的臨床案例拓展分子檢驗(yàn)技術(shù)的應(yīng)用場(chǎng)景，鼓勵(lì)學(xué)生課外研讀文獻(xiàn)、主動(dòng)思考學(xué)習(xí)；將思政元素和專業(yè)知識(shí)有機(jī)融合進(jìn)行課程小結(jié)，增強(qiáng)學(xué)生的專業(yè)自信，提升學(xué)生的思政修養(yǎng)。這種“四步法”教學(xué)設(shè)計(jì)思路清晰，從應(yīng)用到理論再到應(yīng)用，循序漸進(jìn)，以新冠病毒核酸檢測(cè)為主線，將實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的所有知識(shí)點(diǎn)巧妙貫穿其中，能夠讓學(xué)生在專業(yè)知識(shí)、思想道德、邏輯思維和實(shí)踐應(yīng)用等各方面得到最大的提高和收獲。