姚麗梅 張陽兒 陳丁生 趙 威 王 奇 李偉榮△

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405）

急性酒精中毒俗稱醉酒，是指一次攝入大量酒精（乙醇）后發(fā)生的機(jī)體機(jī)能異常狀態(tài)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟傷害最嚴(yán)重。短時(shí)間內(nèi)大量酒精進(jìn)入機(jī)體會(huì)給患者帶來較大傷害，甚至可以直接或間接導(dǎo)致死亡。急性酒精中毒的發(fā)生非常普遍，必須引起高度重視［1］。乙醇進(jìn)入體內(nèi)后，大部分在肝臟中被乙醇脫氫酶（ADH）和乙醛脫氫酶（ALDH）氧化，使肝臟處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，對(duì)肝臟造成嚴(yán)重?fù)p傷［2］。

中醫(yī)認(rèn)為酒性濕熱、味苦、有毒，飲之過多可導(dǎo)致疾病發(fā)生。早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有“酒性苦熱”的記載，巢元方《諸病源候論》論及“酒性有毒，而復(fù)大熱，飲之過多，故毒熱氣滲溢經(jīng)絡(luò)，浸溢臟腑，而生諸病也”，提出酒的毒性，并指出飲酒過度會(huì)導(dǎo)致機(jī)體諸病發(fā)生［3］。急性酒精中毒初期以解酒為主，臨床上使用最多的中藥是醒腦靜注射液，療效得到廣泛確認(rèn)［4］。醒腦靜注射液由麝香、梔子、郁金和冰片4味藥組成，具有開竅醒神、鎮(zhèn)靜止痙、清熱解毒、解郁行氣的功效，對(duì)酒精導(dǎo)致的意識(shí)障礙有顯著的促醒作用。本課題組前期研究表明［5］，醒腦靜注射液能促進(jìn)急性酒精中毒小鼠體內(nèi)乙醇的代謝，縮短小鼠昏迷時(shí)間，但對(duì)肝臟是否有保護(hù)作用并不清楚。本研究將采用急性酒精中毒大鼠模型，探討醒腦靜注射液的促醒作用以及對(duì)大鼠肝臟氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量200～300 g，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（粵）2018-0034。飼養(yǎng)溫度24～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，自由飲食水。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試藥與儀器 醒腦靜注射液，無錫濟(jì)民可信禾藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：10 mL/支，國藥準(zhǔn)字號(hào)Z41020664。ADH、ALDH、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）試劑盒，均購于南京建成生物科技有限公司，批號(hào)分別是：20180612、20180615、20181008、20170809、20170809。Trizol（批號(hào)：184608），購于美國賽默飛世爾科技有限公司；BestarTMqPCR RT Kits（DBI-2220）、Sybr Green qPCR MIX（DBI2043），購于廣州粵穗生物科技有限公司。ADH、ALDH引物由廣州粵穗生物科技有限公司合成。超聲波破碎儀（美國Sonics公司）；KDC-220HR高速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國鉑金埃爾默有限公司）；普通PCR儀（美國PE公司）；Step One PlusTMReal-Time PCR System（美國Applied Biosystems公司）；Nano UV-3000微量核酸蛋白檢測(cè)儀（美國Thermo scientific公司）；制冰機(jī)（日本Sanyo公司）；恒溫水浴鍋（正基儀器有限公司）。

1.3 分組與造模 將40只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d后隨機(jī)分為5組：空白組、模型組和醒腦靜注射液低、中、高劑量組，每組8只。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，空白組大鼠腹腔注射生理鹽水，模型組和給藥組腹腔注射52%乙醇溶液［6-8］，注射量均為10 mL/kg體質(zhì)量。

1.4 給藥方法 待大鼠翻正反射消失后，空白組、模型組靜脈注射生理鹽水，參考文獻(xiàn)［9-10］及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，醒腦靜注射液低、中、高劑量組分別注射醒腦靜注射液1.5、3.0、6.0 mL/kg，各組給藥體積均為6 mL/kg，醒腦靜低、中劑量組用生理鹽水補(bǔ)足相應(yīng)體積。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 記錄大鼠翻正反射消失維持時(shí)間，給予乙醇5 h后處死并立即取肝臟。剪取約1 g肝臟組織，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加入PBS緩沖液用超聲細(xì)胞破碎儀破碎組織，制成10%肝臟勻漿液，靜置10 min后，4℃高速冷凍離心20 min（12 000 g/min），吸取上清液并分裝。分別測(cè)定肝臟ADH、ALDH、SOD活性和肝組織蛋白、MDA、GSH含量。肝組織mRNA經(jīng)提取分離純化，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行熒光定量反應(yīng)。設(shè)計(jì)引物序列見表1。qRTPCR反應(yīng)體系：cDNA模板1 μL，上游引物、下游引物各 0.5 μL，ddH2O 8 μL，2×BestarTMq PCR Master Mix（SYBR Green）10 μL，總體積20 μL。放置于Step One PlusTM熒光定量PCR分析儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性反應(yīng)2 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次。溶解曲線的反應(yīng)條件：95℃反應(yīng)1 min，55℃反應(yīng)1 min，95℃反應(yīng)15 s，循環(huán)1次。記錄各組樣品擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值，通過內(nèi)參均一化處理后，運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 擴(kuò)增基因的引物序列信息

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，多組間均值比較采用單因素方差分析，事后檢驗(yàn)采用LSD。計(jì)量資料以（±s）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠翻正反射消失維持時(shí)間比較 見表2。與模型組比較，醒腦靜注射液各劑量組均能縮短大鼠翻正反射消失維持時(shí)間，中、高劑量組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 各組大鼠翻正反射消失維持時(shí)間比較（h，±s）

表2 各組大鼠翻正反射消失維持時(shí)間比較（h，±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組別模型組醒腦靜注射液低劑量組醒腦靜注射液中劑量組醒腦靜注射液高劑量組n8 8 8 8翻正反射消失維持時(shí)間4.26±0.56 3.92±0.68 2.92±0.24**2.59±0.16**

2.2 各組大鼠肝組織ADH、ALDH、SOD活性比較 見表3。相比空白組，模型組肝組織中ADH和ALDH活性顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，醒腦靜注射液中、高劑量組肝組織中ADH、ALDH、SOD活性顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠肝組織ADH、ALDH、SOD活性比較（U/mg，±s）

表3 各組大鼠肝組織ADH、ALDH、SOD活性比較（U/mg，±s）

組別空白組模型組醒腦靜注射液低劑量組醒腦靜注射液中劑量組醒腦靜注射液高劑量組n 8 8 8 8 8 ADH 4.83±1.94**1.81±1.12 2.58±0.77 3.77±1.65*3.69±0.79**ALDH 1.39±0.20**0.55±0.12 0.54±0.53 1.29±0.33**1.30±0.19**SOD 154.92±20.34 155.95±11.75 164.91±10.76 172.70±20.63*173.92±18.92*

2.3 各組大鼠肝組織GSH、MDA含量比較 見表4。相比空白組，模型組肝組織MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，醒腦靜注射液中、高劑量組肝組織GSH含量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），對(duì)MDA含量無顯著影響。

表4 各組大鼠肝組織GSH、MDA含量比較（μmol/g，±s）

表4 各組大鼠肝組織GSH、MDA含量比較（μmol/g，±s）

組別空白組模型組醒腦靜注射液低劑量組醒腦靜注射液中劑量組醒腦靜注射液高劑量組n 8 8 8 8 8 GSH 2.72±1.36 2.27±1.04 2.67±0.94 4.57±1.89**3.51±0.21*MDA 1.12±0.21**1.63±0.41 1.62±0.31 1.44±0.24 1.54±0.31

2.4 各組大鼠肝組織ADH、ALDH mRNA表達(dá)量比較 見表5。相比空白組，模型組肝組織中ADH、ALDH mRNA表達(dá)量均顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，醒腦靜注射液中、高劑量組ADH mRNA表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），低、中、高劑量組ALDH mRNA表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表5 各組大鼠肝組織ADH、ALDH mRNA表達(dá)量比較（±s）

表5 各組大鼠肝組織ADH、ALDH mRNA表達(dá)量比較（±s）

組別空白組模型組醒腦靜注射液低劑量組醒腦靜注射液中劑量組醒腦靜注射液高劑量組n 8 8 8 8 8 ADH 0.95±0.36**0.42±0.18 0.38±0.21 0.70±0.14*0.76±0.13*ALDH 1.11±0.26**0.13±0.18 0.55±0.10*0.63±0.18**0.51±0.17*

3 討 論

急性酒精中毒以神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟損傷最為常見，機(jī)體攝入的乙醇大部分由肝臟代謝，由于其脂溶性較強(qiáng)，小部分可通過血腦屏障進(jìn)入大腦，作用于腦神經(jīng)細(xì)胞的代謝酶，使中樞神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)興奮性表現(xiàn)。當(dāng)機(jī)體攝入的乙醇過量，超出正常肝臟代謝范圍，導(dǎo)致肝臟處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，造成肝臟氧化應(yīng)激損傷。酒精性肝損傷嚴(yán)重威脅酗酒人群的健康，已成為世界范圍內(nèi)亟待解決的重要公共衛(wèi)生問題。中醫(yī)認(rèn)為酒為濕熱之品，濕熱易困遏脾胃，阻礙氣機(jī)，脾運(yùn)化功能失司，土壅則木郁，導(dǎo)致肝疏泄失常，氣機(jī)郁滯，引起納呆、腹脹、脅痛等癥狀?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究一般認(rèn)為酒精性肝損傷與氧化應(yīng)激、炎癥、線粒體功能障礙、凋亡與乙醛毒性等密切相關(guān)，氧化應(yīng)激損傷為首要原因［11］。

我國古代醫(yī)家對(duì)急性酒精中毒的治法論述頗多，如明代醫(yī)家周慎齋在《周慎齋遺書·卷八·傷酒》中談到“酒客初病，發(fā)不甚重，解酒足矣，續(xù)自病重者，以內(nèi)傷法立方，少加醒酒藥味”，指出急性酒精中毒的中醫(yī)治療原則早期應(yīng)以解酒為主，隨著病情發(fā)展，應(yīng)按照內(nèi)傷疾病擬定治法與處方，同時(shí)配合醒酒藥物。醒腦靜注射液出自清代著名醫(yī)家吳鞠通的《溫病條辨》，是由中藥經(jīng)典復(fù)方安宮牛黃丸精簡(jiǎn)而成的水溶性靜脈注射液，有效解決了傳統(tǒng)丸劑起效緩慢、昏迷患者給藥困難的問題。醒腦靜注射液起效迅速，在臨床上廣泛用于腦梗死、腦出血急性期、顱腦外傷、急性酒精中毒等病癥。方中麝香芳香開竅為君，梔子清熱瀉火、涼血解毒為臣，郁金活血行氣、清心解郁、涼血解毒為佐，協(xié)同君藥、臣藥開竅通絡(luò)，冰片引藥上行為使。諸藥合用，共奏開竅醒神、鎮(zhèn)靜止痙、清熱解毒、解郁行氣之功［12］。醒腦靜注射液中所含的芳香開竅藥麝香和冰片具有快速促醒作用。劉亞敏等［13］研究發(fā)現(xiàn)，麝香、冰片可降低腦缺血時(shí)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)天冬氨酸，升高抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸和甘氨酸，對(duì)抗興奮性氨基酸毒性，起到保護(hù)腦缺血神經(jīng)元的作用，這可能是其芳香開竅機(jī)制之一。本課題組前期研究［14-15］表明，醒腦靜注射液對(duì)酒精性昏迷動(dòng)物模型具有促醒作用，機(jī)制與調(diào)控腦內(nèi)谷氨酸和γ-氨基丁酸及相關(guān)受體NR2A、NR2B及GABAA功能與表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步研究［16］發(fā)現(xiàn)，醒腦靜注射液可增加急性酒精中毒大鼠外側(cè)下丘腦區(qū)覺醒肽-1受體表達(dá)、減少腺苷水平、下調(diào)腺苷-1受體表達(dá)及平衡核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1表達(dá)，達(dá)到促醒作用。

有研究［17-19］表明醒腦靜注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注所致氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。為進(jìn)一步明確醒腦靜注射液使急性酒精中毒大鼠促醒的同時(shí)，對(duì)肝臟氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，筆者開展了本項(xiàng)研究工作。結(jié)果表明，與模型組比較，醒腦靜注射液可顯著縮短急性酒精中毒大鼠翻正反射消失維持時(shí)間，逆轉(zhuǎn)由酒精引起的ADH、ALDH活力下降；基因表達(dá)結(jié)果也顯示醒腦靜注射液也顯著提高肝組織ADH和ALDH的mRNA表達(dá)水平，與ADH、ALDH活力測(cè)定結(jié)果相一致。本研究中急性酒精中毒雖然對(duì)大鼠肝組織SOD活性和GSH含量無明顯影響，但可導(dǎo)致肝臟氧化應(yīng)激損傷，使肝組織產(chǎn)生大量MDA。與模型組比較，醒腦靜注射液能顯著升高SOD和GSH的含量，但對(duì)已產(chǎn)生的MDA無明顯的消除作用，表明醒腦靜注射液可阻止急性酒精中毒所致肝臟氧化應(yīng)激損傷，對(duì)肝臟有保護(hù)作用，可能與方中梔子清熱瀉火、涼血解毒，郁金疏肝活血、行氣解郁功效有關(guān)，其深層機(jī)制有待進(jìn)一步研究。