李軍濤，王 艷，李向前，陳素霞

(石家莊市第八醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

抑郁癥是現(xiàn)代較為常見的心理障礙疾病，患者長(zhǎng)時(shí)間處于情緒低落、運(yùn)動(dòng)抑制的狀態(tài)，對(duì)身體健康造成極大的影響，嚴(yán)重者甚至危及生命。抗抑郁藥是幫助緩解抑制癥的有效方法，目前常見的抗抑郁藥有氟伏沙明、舍曲林、氟西汀、帕羅西汀。這些藥物能夠有效緩解抑郁癥患者的癥狀，但是對(duì)我們體內(nèi)代謝酶CYP2D6有一定的抑制作用。研究抗抑郁藥的抑制性能對(duì)指導(dǎo)臨床用藥有至關(guān)重要的作用，廣大學(xué)者進(jìn)行了很多研究。有學(xué)者提出用高效液相色譜法分析藥物成分的抑制作用，但色譜法存在操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，儀器設(shè)備昂貴的問題[1]；用熒光光譜法對(duì)藥物成分進(jìn)行抑制分析，改善了色譜法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜的問題，但設(shè)備昂貴的問題還是沒有得到很好的解決[2]。而電化學(xué)酶?jìng)鞲衅骶哂胁僮骱?jiǎn)單、儀器簡(jiǎn)單，選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，在2020年對(duì)近 5 年生物傳感器在酶抑制劑類藥物檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，證實(shí)電化學(xué)傳感器能夠有效檢測(cè)酶抑制活性[3]；但是電化學(xué)傳感器的具體應(yīng)用還存在問題。本文在文獻(xiàn)[3]的研究基礎(chǔ)上，針對(duì)傳統(tǒng)酶體外檢測(cè)光譜法、色譜法設(shè)備昂貴的問題，用硝酸和硫酸混合溶液對(duì)多壁碳納米管進(jìn)行羧基化，然后以此為基體制備Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE 傳感器，并探討不同抗抑郁藥物對(duì)CYP2D6 的抑制作用,從而為臨床抗抑郁藥的指導(dǎo)用藥提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

本試驗(yàn)主要材料：硝酸(佛山市華希盛化工有限公司)、硫酸(山東辰達(dá)化工有限公司)、氫溴酸右美沙芬(北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司)、舍曲林(輝瑞制藥有限公司)、帕羅西汀(浙江華海藥業(yè)股份有限公司)、氟西汀(武漢多普樂生物醫(yī)藥有限公司)、氟伏沙明(武漢欣欣佳麗生物科技有限公司)：均為AR；多壁碳納米管(湖北科沃德化工有限公司，>95%)；CYP2D6(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，PMO)。

本試驗(yàn)主要設(shè)備：ADS-1720Q超聲波清洗機(jī) (佛山市安迪信超聲清洗設(shè)備有限公司)；DZF-6090真空干燥箱(上海儀天科學(xué)儀器有限公司)；LIDA-20傅里葉變換紅外光譜儀(天津恒創(chuàng)立達(dá)科技發(fā)展有限公司)；SS-150冷場(chǎng)掃描電子顯微鏡(深圳市善時(shí)儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1c-MWCNTs的制備

(1)將H2SO4與HNO3按照體積比3∶1混合，取10 mL混合溶液，將10 mg多壁碳納米管分散于混合溶液中；

(2)將混合溶液置于ADS-1720Q型超聲波清洗機(jī)中進(jìn)行超聲分散，超聲時(shí)間為30 min。取出混合溶液后，在室溫條件下充分?jǐn)嚢?，攪拌時(shí)間為4 h；

(3)對(duì)混合溶液進(jìn)行抽濾，并用去離子水沖洗抽濾產(chǎn)物4次。然后將產(chǎn)物置于DZF-6090型真空干燥箱內(nèi)充分干燥，干燥溫度和時(shí)間分別為60 ℃和12 h，得到羧基化多壁碳納米管；

(4)在4 mL去離子水中融入4 mg羧基化多壁碳納米管；然后置于ADS-1720Q型超聲波清洗機(jī)中超聲分散，超聲時(shí)間為30 min。

1.2.2Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE 傳感器的組裝

(1)依次在1.0、0.3和0.05 μm的α-氧化鋁粉中對(duì)玻碳電極進(jìn)行打磨；然后依次在體積比為1∶1的硝酸溶液、乙醇額溶液和去離子水中進(jìn)行超聲清洗，清洗時(shí)間為3 min。撈出后置于室溫通風(fēng)環(huán)境中干燥；

(2)將玻碳電極置于濃度為1 mol/L的H2SO4溶液中，然后采用CV法對(duì)玻碳電極進(jìn)行活化[4]；CV法參數(shù)如表1所示 ；

表1 CV法參數(shù)Tab.1 CV method parameters

(3)活化后在玻碳電極上滴涂5 μL羧基化多壁碳納米管溶液，然后置于室溫通風(fēng)環(huán)境中干燥。將干燥后電極置于100 mmol/L的EDC/NHS 溶液中浸泡1 h，之后在電極上滴涂5 μL的CYP2D6 酶溶液，繼續(xù)干燥，干燥溫度和時(shí)間分別為4 ℃和12 h；

(4)用pH值為7.4的濃度為0.1 mol/L的PBS沖洗掉玻碳電極中未固化的酶；然后在電極上滴加5 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的Nafion 溶液，繼續(xù)置于溫度為4 ℃環(huán)境下干燥保存[5]。

1.2.3Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE 傳感器的電化學(xué)測(cè)量條件

本試驗(yàn)采用三電極體系，其中參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉑絲電極。傳感器直接電化學(xué)行為由CV法測(cè)得，循環(huán)伏安掃描電位和掃描速度分別為-0.8～0.1 V、50 mV/s[6]。對(duì)抗抑郁藥的測(cè)定則是采用DPV法，以含有20 μmol/L、pH值為7.4的右美沙芬作為測(cè)試底液，測(cè)試溫度為20 ℃。

抗抑郁藥抑制率(Inhibition)表達(dá)式[7]：

擬制率=(ip0-ipt)/ip0×100%

(1)

式中：ip0為抗抑郁藥抑制前的電流信號(hào)；ipt為抗抑郁藥抑制后的電流信號(hào)。

1.3 性能表征

1.3.1紅外光譜分析

用LIDA-20型傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)c-MWCNTs進(jìn)行掃描。

1.3.2掃描電鏡分析

用導(dǎo)電膠將c-MWCNTs固定在樣品臺(tái)上，然后放入SS-150型冷場(chǎng)掃描電子顯微鏡中進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 c-MWCNTs表征

2.1.1c-MWCNTs 的紅外表征

圖1為c-MWCNTs 的紅外譜圖。

圖1 c-MWCNTs的紅外譜圖Fig.1 Infrared spectrum of c-MWCNTs

2.1.2掃描電鏡表征

圖2為c-MWCNTs的掃描電鏡圖，其中圖2(a)為整體形貌；圖2(b)為局部放大圖。由圖2可知， c-MWCNTs較長(zhǎng)，管徑分布較為均勻，且外壁光滑。

圖2 c-MWCNTs的掃描電鏡圖Fig.2 SEM of c-MWCNTs

2.2 Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE 電化學(xué)行為

2.2.1電化學(xué)交流阻抗

圖3為玻碳電極交流阻抗譜圖；測(cè)試底液為0.1 mol/L的KCl和5 mmol/L的[Fe(CN)6]3-/4-混合溶液。

a-玻碳電極；b-c-MWCNTs/玻碳電極；c-CYP2D6/c-MWCNTs/玻碳電極圖3 交流阻抗譜圖Fig.3 AC impedance spectrum

由圖3可知，未經(jīng)修飾的玻碳電極電子轉(zhuǎn)移阻抗大概為590 Ω。在玻碳電極修飾了羧基化多壁碳納米管后，其電子轉(zhuǎn)移阻抗下降比較明顯，這證明了羧基化多壁碳納米管具有良好的導(dǎo)電性，對(duì)電極表面的電子轉(zhuǎn)移有較好的促進(jìn)作用[9]。將CYP2D6固定在修飾電極后，電子轉(zhuǎn)移的阻抗出現(xiàn)小幅度增加；這是因?yàn)镃YP2D6為電的不良導(dǎo)體，玻碳電極固定了CYP2D6后，離子難以從溶液擴(kuò)散至電極表面，使得阻抗變大。

2.2.2電極修飾過程直接化學(xué)

圖4為循環(huán)伏安曲線；測(cè)試底液是濃度為0.1 mol/L、pH值為7.4的PBS溶液;掃描速度為50 mV/s。

a-玻碳電極；b-c-MWCNTs/玻碳電極；c-CYP2D6/c-MWCNTs/玻碳電極

由圖4可知，未經(jīng)CYP2D6修飾的玻碳電極和多壁碳納米管修飾電極上都沒有電流峰存在；而經(jīng)過CYP2D6修飾后，循環(huán)伏安曲線有一對(duì)比較明顯的氧化還原峰出現(xiàn)[10-13]。這證明經(jīng)過CYP2D6的修飾，玻碳電極上發(fā)生一定的電子轉(zhuǎn)移，進(jìn)而表明在玻碳電極上成功固定了CYP2D6。

2.3 Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE 在探針底物中的電催化

圖5為Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE傳感器在不同濃度的右美沙芬中，用DPV法測(cè)定的還原峰電流。

圖5 Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE傳感器在不同濃度右美沙芬中的還原峰電流Fig.5 Reduction peak current ofNafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE sensorin different concentrations of dextromethorphan

由圖5可知，隨右美沙芬濃度的增加，還原峰電流也持續(xù)增加；這證明本文制備的傳感器具備了CYP2D6對(duì)抑郁藥的代謝能力。

2.4 傳感器優(yōu)化

圖6為DPV法測(cè)定Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE傳感器在含有10 μmol/L帕羅西汀，pH值為7.4、濃度為0.1 mol/L的PBS溶液中的抑制前后酶的生物活性，其中圖6(a)為還原峰電流信號(hào)隨時(shí)間變化圖；圖6(b)為抑制率隨時(shí)間變化圖。

圖6 抑制前后酶的生物活性Fig.6 Biological activity of enzyme before and after inhibition

由圖6可知，抑制前期，酶抑制率快速增加。當(dāng)抑制時(shí)間達(dá)到36 min時(shí)，酶抑制率高達(dá)70.3%；當(dāng)繼續(xù)增加抑制時(shí)間，抑制率增加趨勢(shì)變緩，因此，本試驗(yàn)選擇的抑制時(shí)間為36 min。

2.5 抗抑郁藥對(duì)CYP2D2酶活性的抑制

表2為幾種抗抑郁藥的抑制效果。其中IC50是抑制率為50%時(shí)抗抑郁藥的濃度，IC50值大小表示該抑郁藥對(duì)CYP2D6的抑制能力。IC50值越小，則抗抑郁藥對(duì)CYP2D6抑制能力越強(qiáng)；當(dāng)IC50比1 μmol/L小時(shí)，則該抑制劑為強(qiáng)抑制劑；當(dāng)IC50位于1～10 μmol/L時(shí)，則該抑制劑為中抑制劑；當(dāng)IC50位于10～50 μmol/L時(shí)，則該抑制劑為弱抑制劑；當(dāng)IC50大于50 μmol/L時(shí)，該抑制劑為較弱抑制劑，此時(shí)可認(rèn)定該抑制劑對(duì)CYP2D6沒有抑制[14-17]。

表2 幾種抗抑郁藥的抑制效果Tab.2 Inhibitory effect of several antidepressants μmol/L

由表2可知，幾種抗抑郁藥對(duì)CYP2D6的抑制能力從小到大依次為：氟伏沙明(IC50 22.8 μmol/L)、舍曲林(IC50 10 μmol/L)、氟西汀(IC50 3.9 μmol/L)、帕羅西汀(IC50 1.8 μmol/L)，這證明了舍曲林和氟伏沙明為弱抑制劑；帕羅西汀和氟西汀為中抑制劑。

2.6 傳感器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

測(cè)定Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE傳感器在含有20 μmol/L右美沙芬，濃度為0.1 mol/L、pH值為7.4的PBS溶液中的還原峰電流值。10次試驗(yàn)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3%，這證明了本文制備的傳感器具有比較好的重現(xiàn)性。將制備好的電極置于溫度4 ℃條件下進(jìn)行保存，7 d后觀察信號(hào)損失為4.5%；這證明該傳感器具有較好的穩(wěn)定性。

3 電化學(xué)傳感器的應(yīng)用

基于以上傳感器對(duì)不同抗抑郁治療藥物抑制作用的分析，以對(duì)CYP2D6抑制最強(qiáng)的帕羅西汀藥物為例，結(jié)合于2020年1月～2021年4月收治的抑郁患者102例作為研究對(duì)象，將102例患者分為觀察組和對(duì)照組，其中對(duì)照組給予帕羅西汀，每早1次；觀察組給予帕羅西汀+失眠認(rèn)知行為指導(dǎo)。由此對(duì)比患者在治療前及治療1、3和6個(gè)月的PSQ-T評(píng)分[18-20]；具體結(jié)果如圖7所示。

圖7 治療前后的PSQ-T評(píng)分對(duì)比Fig.7 Comparison of the PSQ-T scores beforeand after treatment

由圖7可知，與治療前比較，2組患者治療1、3和6個(gè)月后PSQ-T評(píng)分顯著降低(P<0.05)；治療1個(gè)月聯(lián)用PSQ-T評(píng)分顯著低于單用組(P<0.05)。在采用帕羅西汀+失眠認(rèn)知行為指導(dǎo)的觀察組的PSQ-T得分低于對(duì)照組，說明采用這種治療方式可有效治療抑郁并有失眠的患者。

4 結(jié)語

本試驗(yàn)以體積比為3∶1的H2SO4與HNO3混合溶液制備的以c-MWCNTs為基底制備Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE 傳感器。通過對(duì) c-MWCNTs微結(jié)構(gòu)和Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE 傳感器電化學(xué)行為進(jìn)行表征，得到的具體結(jié)論為：

(1)經(jīng)過體積比為3∶1的H2SO4與HNO3混合溶液作用，成功在多壁碳納米管上引入羧基。且制備的c-MWCNTs管徑均勻，外壁較光滑；

(2)玻碳電極表面成功固定CYP2D6后，離子難以從溶液擴(kuò)散至電極表面，傳感器阻抗變大；

(3)DPV法測(cè)定的還原峰電流證明Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE傳感器具備CYP2D6對(duì)抑郁藥的代謝能力；

(4)DPV法對(duì)抑制前后酶的生物活性進(jìn)行測(cè)定，在抑制時(shí)間為36 min時(shí)，酶抑制率為70.3%。而后隨時(shí)間增加，酶抑制增長(zhǎng)速度變慢，確定抑制時(shí)間為36 min；

(5)幾種抗抑郁藥中，舍曲林和氟伏沙明為弱抑制劑，帕羅西汀和氟西汀為中抑制劑。對(duì)CYP2D6的抑制能力大小依次為：氟伏沙明(IC50 22.8 μmol/L)、舍曲林(IC50 10 μmol/L)、氟西汀(IC50 3.9 μmol/L)、帕羅西汀(IC50 1.8 μmol/L)；

(6)傳感器在4 ℃環(huán)境下保存7 d，信號(hào)損失僅為4.5%；10次還原峰電流值標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為4.3%，證明本試驗(yàn)制備的傳感器具有較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。