李樂(lè)，黃浩，羅苑苑，溫敏勇

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

膿毒癥（sepsis），被定義為機(jī)體對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)所引起的危及生命的器官功能障礙[1-2]，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)危急重癥領(lǐng)域中的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。膿毒癥歸屬于中醫(yī)學(xué)“外感熱病”“溫毒”等范疇。中醫(yī)藥在膿毒癥治療領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[3-4]?；⒄仁寝た贫嗄晟荼局参锘⒄龋≒olygonum cuspidatumSieb.etZucc.）的干燥根莖和根，別名花斑竹、大葉蛇總管、陰陽(yáng)蓮等，性寒，味苦，歸肝、膽、肺經(jīng)[5]，具有清熱利濕解毒、活血散瘀止痛、止咳化痰的功效，臨床常用于治療濕熱蘊(yùn)結(jié)下焦、肺熱咳嗽、熱結(jié)便秘、水火燙傷等病證?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，虎杖中主要含有蒽醌類(lèi)（大黃素、大黃酸、大黃酚等），二苯乙烯類(lèi)（虎杖苷、白藜蘆醇等），黃酮類(lèi)（橙皮素、蘆丁、槲皮素等），香豆素類(lèi)以及一些脂肪酸類(lèi)化合物，能通過(guò)抗炎、抗氧化、改善細(xì)胞連接、抗細(xì)胞凋亡等多種作用改善膿毒癥預(yù)后[6-12]。但虎杖治療膿毒癥過(guò)程中的關(guān)鍵成分及其具體機(jī)制仍不明確，因此本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)虎杖在膿毒癥治療中的主要活性成分及核心靶標(biāo)，以期為虎杖在膿毒癥治療領(lǐng)域的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 虎杖有效成分及靶標(biāo)的檢索及篩選 選擇中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP），以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及藥物相似度（drug-likeness，DL）≥0.18作為篩選條件，獲得虎杖的有效成分，同時(shí)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行補(bǔ)充。再利用TCMSP靶標(biāo)預(yù)測(cè)模型獲得虎杖有效成分的作用靶標(biāo)。

1.2 疾病靶標(biāo)的篩選 以“sepsis”為檢索詞，分別在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行關(guān)鍵詞檢索，將獲得的靶標(biāo)進(jìn)行合并、去重，得到膿毒癥的疾病靶標(biāo)。把檢索得到的膿毒癥靶標(biāo)與虎杖有效成分靶標(biāo)通過(guò)R軟件合并處理，取兩者交集并繪制韋恩圖。

1.3 藥物-成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 把虎杖的有效成分、藥物與疾病交集靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中，剔除孤立的有效成分及靶標(biāo)數(shù)據(jù)，得到藥物-成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點(diǎn)表示虎杖、有效成分及潛在靶標(biāo)。再使用軟件自帶的網(wǎng)絡(luò)分析工具計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，根據(jù)節(jié)點(diǎn)連接度（Degree）、介度中心性（Betweenness Centrality）及緊密度中心性（Closeness Centrality）對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。同時(shí)把藥物與疾病的交集靶標(biāo)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)中，限定物種為人類(lèi)（Homo sapiens），最低相互作用閾值為0.4，獲取蛋白之間相互作用的關(guān)系數(shù)據(jù)，再導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0中繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）圖。

1.4 基因本體論（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析 將藥物與疾病的交集靶標(biāo)通過(guò)R軟件的Cluster Profiler包進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，以P＜0.05和Q＜0.05作為篩選條件，得到差異有顯著性意義的生物過(guò)程和靶標(biāo)通路并繪制相關(guān)的柱狀圖。

1.5 分子對(duì)接結(jié)果驗(yàn)證 選擇虎杖度值（Degree）前5位的有效成分作為配體，度值前5位的核心靶標(biāo)作為受體，在RCSB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）下載有效成分及靶標(biāo)對(duì)應(yīng)的PDB文件或mol2文件，采用Autodock軟件進(jìn)行分子模擬對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 虎杖有效成分及靶標(biāo)的篩選 在TCMSP中檢索虎杖，得到化合物62個(gè)。以O(shè)B≥30%及DL≥0.18為篩選條件，加以結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)篩查，共得到10個(gè)化合物（見(jiàn)表1）。得到虎杖作用靶標(biāo)1 068個(gè)，通過(guò)與虎杖有效成分進(jìn)行比對(duì)，去重后得到205個(gè)作用靶標(biāo)。

表1 虎杖的有效成分Table 1 Active constituents of PolygoniCuspidati Rhizoma et Radix

2.2 膿毒癥靶標(biāo)的篩選 在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)中，以“sepsis”為檢索詞檢索，經(jīng)合并、去重后，得到膿毒癥的疾病靶標(biāo)共2 890個(gè)。取藥物作用靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)交集，得到63個(gè)交集基因靶標(biāo)（見(jiàn)圖1），即虎杖治療膿毒癥潛在靶標(biāo)。

2.3 “藥物-成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 把虎杖的有效成分、藥物與疾病交集靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中，剔除孤立的節(jié)點(diǎn)后，得到藥物-成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖2），包含72節(jié)點(diǎn)，313條邊。其中，靶標(biāo)節(jié)點(diǎn)有63個(gè)，有效成分節(jié)點(diǎn)7個(gè)。利用Cytoscape 3.8.0網(wǎng)絡(luò)分析工具計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，分析得到虎杖中最主要的前7個(gè)有效成分為槲皮素（quercetin，度值=138），木犀草素（luteolin，度值=77），β-谷甾醇（beta-sitosterol，度值=11），毒扁豆次堿（physovenine，度值=9），大黃酚（rhein，度值=5），兒茶酚（catechin，度值=5），6，8-二羥基-7-甲氧基呫噸酮（6，8-dihydroxy-7-methoxyxanthone，度值=4）以及最主要的前22個(gè)基因（見(jiàn)表2）。

表2 虎杖治療膿毒癥的前22個(gè)主要靶標(biāo)信息Table 2 Information on the top 22 major targets for PolygoniCuspidatiRhizoma et Radix in the treatment of sepsis

圖2 虎杖治療膿毒癥“藥物-成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)”圖Figure 2“Drug-component-target network”diagram for Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix in the treatment of sepsis

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將63個(gè)交集基因?qū)隨TRING平臺(tái)構(gòu)建藥物-疾病靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)，取最低相互作用閾值為0.4，得到PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)。把PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0中，經(jīng)過(guò)分析得到網(wǎng)絡(luò)平均度值為19.4，最主要的前10個(gè)靶標(biāo)分別是TP53（度值=49），IL6（度值=44），ESR1（度值=41），CASP3（度 值=41），HIF1A（度 值=40），VEGFA（度值=40），MYC（度值=39），EGFR（度值=39），PPARG（度值=37），CCND1（度值=35）。度值越大，說(shuō)明該節(jié)點(diǎn)很可能就是關(guān)鍵成分或關(guān)鍵靶標(biāo)（見(jiàn)圖3）。

圖3 虎杖治療膿毒癥的藥物-疾病靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Figure 3 Network diagram of drug-disease target protein interaction for Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix in the treatment of sepsis

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 經(jīng)過(guò)GO功能富集分析，得到1 321個(gè)GO條目，其中包含生物過(guò)程（BP）1 206個(gè)、細(xì)胞組成（CC）17個(gè)、分子功能（MF）97個(gè)。按校正P值從小到大選取每個(gè)分類(lèi)的前8個(gè)條目繪制柱形圖（見(jiàn)圖4）。結(jié)果顯示，生物過(guò)程主要涉及細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、活性氧代謝過(guò)程、藥物反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路的調(diào)控與負(fù)調(diào)控等；細(xì)胞組成則涉及膜筏、膜微區(qū)、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、髓鞘、基底等離子體膜、核被膜等；分子功能涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素或泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與細(xì)胞凋亡過(guò)程、活化轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、氧化還原酶活性等。同時(shí)經(jīng)過(guò)KEGG富集分析，共得到126條通路，按富集到通路上的靶標(biāo)數(shù)目選取前20條通路繪制氣泡圖（見(jiàn)圖5），其中，最主要的有脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、PI3K-Akt信號(hào)通路、人類(lèi)巨細(xì)胞病毒感染、細(xì)胞凋亡、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、MAPK信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路等。結(jié)果表明，虎杖主要通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)及脂質(zhì)代謝等通路治療膿毒癥。

圖4 虎杖治療膿毒癥潛在靶標(biāo)的GO功能分析Figure 4 GO functional analysis of potentialtargets of PolygoniCuspidatiRhizoma et Radix in the treatment of sepsis

圖5 虎杖治療膿毒癥潛在靶標(biāo)的KEGG通路分析Figure 5 Analysis of the KEGG pathway for potential targets of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix in the treatment of sepsis

2.6 活性成分與關(guān)鍵靶標(biāo)分子對(duì)接結(jié)果 為明確所篩選的虎杖活性成分是否通過(guò)關(guān)鍵靶標(biāo)發(fā)揮治療膿毒癥的作用，我們通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行初步驗(yàn)證。利用AutoDock軟件對(duì)度值前5位的有效成分與度值前5位的核心靶標(biāo)進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示分子與靶標(biāo)最低結(jié)合能均小于0，表明配體與受體均可進(jìn)行自發(fā)結(jié)合。見(jiàn)圖6。最低結(jié)合能≤-5.0 kJ·mol-1即表明藥效分子與蛋白對(duì)接效果良好。結(jié)合能越低，表明分子與蛋白結(jié)合能力越強(qiáng)。本研究大部分結(jié)合能均≤-5.0 kJ·mol-1，其中β-谷甾醇、毒扁豆次堿、大黃酚的結(jié)合能均＜-5.0 kJ·mol-1，結(jié)合能力較強(qiáng)。TP53、PTGS1與有效成分結(jié)合能力為良好，代表有效成分可能主要通過(guò)這2個(gè)核心靶標(biāo)治療膿毒癥。

圖6 虎杖有效成分與膿毒癥核心靶標(biāo)分子對(duì)接結(jié)合能熱圖Figure 6 Molecular docking binding energy heat map of the active ingredients of PolygoniCuspidatiRhizoma et Radix and the core target molecules of sepsis

本研究選取結(jié)合能最低，即結(jié)合能力最強(qiáng)的有效成分與核心靶標(biāo)在Pymol軟件繪圖（見(jiàn)圖7）。其中，β-谷甾醇和木犀草素與核心靶標(biāo)的結(jié)合能力最強(qiáng)，β-谷甾醇分布與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGFA）在PRO-28處及 與TP53在GLU-97、SER-93處形成氫鍵，木犀草素則與PTGS1在GLU-465、CYS-36、CYS-47處和與IL6在SER-46、THR-42、ASP-159、NLE-48處形成氫鍵，木犀草素的結(jié)合能力強(qiáng)于β-谷甾醇，而毒扁豆次堿與RELA在PRO-47處形成氫鍵。

圖7 虎杖有效成分與膿毒癥核心靶標(biāo)分子對(duì)接模式圖Figure 7 Molecular docking diagram of the active components of PolygoniCuspidatiRhizoma et Radix with the core target molecules of sepsis

3 討論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選出7個(gè)虎杖主要活性成分，分別是槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、毒扁豆次堿、大黃酚、兒茶酚、6，8-二羥基-7-甲氧基呫噸酮，以及潛在的治療膿毒癥靶標(biāo)63個(gè)。PPI網(wǎng)絡(luò)顯示度值前10位的靶標(biāo)分別是TP53（49）、IL6（44）、ESR1（41）、CASP3（41）、HIF1A（40）、VEGFA（40）、MYC（39）、EGFR（39）、PPARG（37）、CCND1（35），表明這10個(gè)靶標(biāo)是虎杖治療膿毒癥潛在的關(guān)鍵靶標(biāo)。根據(jù)GO功能和KEGG富集結(jié)果顯示，這些靶標(biāo)主要涉及PI3K-Akt、AGE-RAGE、TNF、MAPK等信號(hào)通路。這些信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)和免疫應(yīng)答、細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞自噬及凋亡密切相關(guān)。其中，PI3K-Akt信號(hào)通路可通過(guò)介導(dǎo)多種固有免疫細(xì)胞在膿毒癥炎癥反應(yīng)與免疫應(yīng)答的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。MAPK信號(hào)通路主要參與細(xì)胞生長(zhǎng)分化、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等多種生理過(guò)程，對(duì)該通路的調(diào)控可發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡、減輕膿毒癥器官損傷等作用[14]。嚴(yán)重感染、器官功能障礙以及免疫失衡始終是膿毒癥病程中較為突出的幾大難題，因此，本研究結(jié)果提示，虎杖在膿毒癥治療中可通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等發(fā)揮多靶點(diǎn)效應(yīng)。

在分子對(duì)接中，虎杖的核心化合物β-谷甾醇、毒扁豆次堿、大黃酚與TP53、PTGS1的結(jié)合能均＜-5.0 kJ·mol-1，說(shuō)明這些核心化合物與受體蛋白的結(jié)合能力較強(qiáng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了富集分析得出的結(jié)果。其中，β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗抑郁、抗脫發(fā)等多種生物活性，在腎臟、心血管、呼吸系統(tǒng)等多種類(lèi)疾病中具有較好的功效[15]。大黃酚具有抗腫瘤、抗炎、保護(hù)心肌損傷和神經(jīng)等多種藥理作用[16]。尚未發(fā)現(xiàn)毒扁豆次堿在膿毒癥中的應(yīng)用，有望成為新的潛在活性成分。在靶標(biāo)方面，IL6是經(jīng)典的炎癥相關(guān)因子，對(duì)膿毒癥預(yù)后的預(yù)測(cè)具有較大價(jià)值，且可作為新型冠狀病毒肺炎危重癥的臨床指標(biāo)預(yù)警因子[17-18]。VEGFA是調(diào)節(jié)血管通透性的細(xì)胞因子，分為促血管生成和促炎作用的VEGF-A165a和抗血管生成、抗炎和細(xì)胞保護(hù)作用的VEGF-A165b兩型。但VEGFA在膿毒癥不同階段參考意義不同，目前尚無(wú)定論[19]。低氧誘導(dǎo)因子（HIF）是人體對(duì)適應(yīng)低氧環(huán)境的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在急性低氧反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。膿毒癥早期腸上皮細(xì)胞低氧能量障礙是腸功能障礙重要誘因，機(jī)體可能通過(guò)上調(diào)HIF-1α，促進(jìn)能量代謝，改善膿毒性腸道黏膜屏障損傷[20]。人類(lèi)腫瘤相關(guān)性最高的基因TP53、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶1（PTGS1）在膿毒癥中的作用尚不明確，有望成為潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，虎杖可能通過(guò)β-谷甾醇、毒扁豆次堿、大黃酚等活性成分，作用于TP53、IL6、CASP3、HIF1A、VEGFA等關(guān)鍵靶標(biāo)，發(fā)揮對(duì)PI3K-Akt、AGE-RAGE、MAPK等信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而通過(guò)干預(yù)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞自噬、免疫應(yīng)答等機(jī)制治療膿毒癥。此結(jié)果進(jìn)一步縮小了虎杖治療膿毒癥的關(guān)鍵成分、核心靶標(biāo)與信號(hào)通路范圍，初步揭示了虎杖治療膿毒癥的可能作用機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)，并在既往研究[8]基礎(chǔ)上為虎杖治療膿毒癥的科學(xué)性與可行性提供了有力支持，可為后續(xù)虎杖治療膿毒癥的機(jī)制研究、臨床應(yīng)用以及含有虎杖的中藥復(fù)方干預(yù)膿毒癥治療相關(guān)應(yīng)用研究提供科學(xué)參考。本研究尚未進(jìn)一步開(kāi)展細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，今后可在此基礎(chǔ)上深入探討虎杖治療膿毒癥的相關(guān)作用機(jī)制并拓寬虎杖及含虎杖中藥復(fù)方的臨床應(yīng)用。