湯麗麗，郭潔，李晶，劉蓉，范曉靜

（1.邯鄲市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北邯鄲 056002；2.邯鄲市第一醫(yī)院紡醫(yī)院區(qū)麻醉科，河北邯鄲 056002；3.邯鄲市第一醫(yī)院財務(wù)科，河北邯鄲 056002）

宮頸癌（cervical cancer）是女性常見的惡性腫瘤。鉑類抗腫瘤藥物是宮頸癌重要的化療藥物，包括順鉑（cisplatin，DDP）、卡鉑等[1-2]。臨床中，DDP比卡鉑更常用，但患者DDP耐藥性的產(chǎn)生限制了DDP的廣泛應(yīng)用[3-4]。因此，提高宮頸癌細(xì)胞的DDP敏感性和逆轉(zhuǎn)DDP耐藥性具有重要的研究意義。來源于植物的天然產(chǎn)物在抗腫瘤藥物領(lǐng)域占有重要的地位[5-6]。血根堿（sanguinarine）是從白屈菜、博落回罌粟科植物中提取的一種苯菲啶異喹啉類生物堿，具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗真菌，改善肝功能，提高免疫力等多種藥理活性[7-10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，血根堿具有抗腫瘤作用，可有效抑制結(jié)直腸癌、胰腺癌和乳腺癌等[11-13]；但尚未見其在宮頸癌中應(yīng)用的研究。因此，本研究以DDP耐藥的人宮頸癌Hela細(xì)胞（HeLa/DDP）為模型，探討血根堿對HeLa/DDP細(xì)胞增殖的影響，以期闡明血根堿抗宮頸癌DDP耐藥的作用及機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及培養(yǎng) 人宮頸癌HeLa細(xì)胞，購自上海奧陸生物科技有限公司。HeLa細(xì)胞以含有10%胎牛血清、100μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在5%CO237℃條件下培養(yǎng)。

1.2 藥物、試劑與儀器 血根堿（≥98%，成都曼思特生物科技有限公司生產(chǎn)，分子式：C20H14NO4；分子量：332.33）；DDP，上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)，批號：C295225。轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司）；10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）檢測試劑盒、蛋白提取試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）；牛血清白蛋白（BSA）（美國Millipore公司）；TGF-β1、p15、Smad2、磷酸化Smad2（p-Smad2）、β-肌動蛋白（β-actin）等鼠抗兔多單克隆抗體（英國Abcam公司）；含有辣根過氧化物酶（HRP）結(jié)合的山羊抗兔IgG抗體（美國CST公司）；ECL發(fā)光液（美國Thermo Fisher Scientific公司）。Synergy H4全功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；PowerPac Basic電泳儀、Gel Doc XR一體式凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 順鉑耐藥細(xì)胞株HeLa/DDP模型構(gòu)建 取處于對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，以100倍半數(shù)抑制濃度（IC50）為誘導(dǎo)劑量，用DDP誘導(dǎo)培養(yǎng)2 h后撤去含藥培養(yǎng)基，用PBS漂洗3次，加入常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每天換液去除死細(xì)胞。10～15 d后，存活的細(xì)胞生長恢復(fù)，進(jìn)入對數(shù)生長期后進(jìn)行消化處理。傳代3次后，重復(fù)上述操作4次。之后延長藥物作用時間為4 h，重復(fù)8次?？傆嫾铀幾饔?2次，誘導(dǎo)過程共歷時6個月，最后得到DDP耐藥細(xì)胞株HeLa/DDP。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 分3組：Hela/DDP組、Hela/DDP+DMSO組、Hela/DDP+血根堿組。Hela/DDP組為空白對照組，只給予原培養(yǎng)基處理；Hela/DDP+血根堿組為血根堿處理組，給予2μmol/L血根堿[14]（0.1%DMSO為溶媒）處理；Hela/DDP+DMSO組為陰性對照組，給予與血根堿相同體積的溶媒0.1%DMSO處理。

在隨后的拯救實(shí)驗(yàn)中，分4組：DMSO組、血根堿組、生理鹽水+血根堿組、TGF-β1+血根堿組。DMSO組、血根堿組的處理方式與上述分組相同；TGF-β1+血根堿組給予5 ng/mL TGF-β1[15]（以生理鹽水為溶媒）預(yù)處理6 h，然后加入2μmol/L血根堿后培養(yǎng)72 h；生理鹽水+血根堿組給予相同體積的生理鹽水合相同濃度的血根堿進(jìn)行處理。

1.5 MTT法測定HeLa/DPP細(xì)胞增殖能力 將HeLa/DDP細(xì)胞接種于96孔板中，2×104/孔，在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h。隨后按照“1.4”項(xiàng)分組處理24、48、72 h。將MTT（5 mg/mL）加入培養(yǎng)基中，并用150μL DMSO溶解甲臜晶體。應(yīng)用酶標(biāo)儀以490 nm波長讀取吸光度（OD）數(shù)值。計算細(xì)胞生長抑制率，公式：細(xì)胞生長抑制率（%）=（對照組OD平均值-實(shí)驗(yàn)組OD平均值）/對照組OD平均值×100%。并計算半數(shù)最大抑制濃度（IC50）。

1.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測HeLa/DDP細(xì)胞TGF-β1、p-Smad2、Smad2、p15蛋白表達(dá) 將HeLa/DDP細(xì)胞接種到48孔板中，2×105/孔，細(xì)胞貼壁6 h后再按照“1.4”項(xiàng)分組處理72 h。用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)蛋白并通過BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。每個泳道上樣15μg蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰氨凝膠電泳（PAGE），然后將分離膠上的蛋白樣本電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。膜在室溫下用TBST溶解的5%BSA封閉40 min。然后將膜與指定的一抗[TGF-β1（稀釋比1∶1 000）、p-Smad2（稀釋比1∶2 000）、Smad2（稀釋比1∶2 000）、p15（稀釋比1∶1 000）和β-actin（稀釋比1∶2 000）]在4℃孵育過夜，在室溫下用HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（稀釋比1∶5 000）孵育40 min。每個步驟完成后采用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次5 min。應(yīng)用ECL發(fā)光液顯影。最后，采用ImageJ軟件分析電泳條帶，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度值比值表示。

1.7 統(tǒng)計方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，然后進(jìn)行最小顯著性差異檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌Hela/DDP細(xì)胞株模型的建立 以親本宮頸癌細(xì)胞系HeLa為基礎(chǔ)，建立DDP耐藥細(xì)胞株HeLa/DDP模型。采用MTT法觀察HeLa細(xì)胞系DDP耐藥水平。對DDP敏感的HeLa和DDP耐藥的HeLa/DDP細(xì)胞用不同濃度（0、0.5、1.0、1.5、2.0μg/mL）的DDP處理48 h，確立半數(shù)最大抑制濃度（IC50）值分別為5.821μg/mL和28.88μg/mL，結(jié)果見圖1。HeLa/DDP細(xì)胞系的IC50值約是HeLa細(xì)胞系的5倍，表明HeLa/DDP對DDP的耐藥性明顯高于HeLa細(xì)胞。

2.2 血根堿抑制HeLa/DDP細(xì)胞的增殖 為了觀察血根堿對Hela/DDP細(xì)胞增殖的影響，給予血根堿處理HeLa/DDP細(xì)胞24、48、72 h。圖2結(jié)果顯示，與未經(jīng)血根堿處理的細(xì)胞相比，血根堿處理的HeLa/DDP細(xì)胞的生長抑制率顯著增加（P＜0.05），表明血根堿可以抑制HeLa/DDP細(xì)胞的增殖。

圖2 MTT法測定HeLa/DDP細(xì)胞生長抑制率結(jié)果Figure 2 Results of the growth inhibition rate of HeLa/DDP cells by MTT assay

2.3 血根堿通過TGF-β1/Smad信號通路調(diào)控Hela/DDP細(xì)胞增殖 采用Western Blot法檢測血根堿誘導(dǎo)Hela/DDP細(xì)胞TGF-β1/Smad通路中TGF-β1、p-Smad2/Smad2和p15蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示：與Hela/DDP+DMSO組比較，Hela/DDP+血根堿組中的TGF-β1、p-Smad2/Smad2和p15蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；同Hela/DDP組相比較，Hela/DDP+DMSO組0.1%DMSO對上述3種分子的蛋白表達(dá)無明顯影響。

圖3 血根堿對Hela/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1、p-Smad2/Smad2和p15蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effect of sanguinarine on protein expressions of TGF-β1，p-Smad2/Smad2 and p15 in Hela/DDP cells

2.4 TGF-β1緩解了血根堿誘導(dǎo)的Hela/DDP細(xì)胞增殖抑制 本研究進(jìn)行了拯救實(shí)驗(yàn)，以5 ng/mL TGF-β1對Hela/DDP細(xì)胞進(jìn)行了預(yù)處理。圖4結(jié)果顯示：與生理鹽水+血根堿組比較，TGF-β1+血根堿組Hela/DDP細(xì)胞生長抑制率顯著下降（P＜0.05）；血根堿組與生理鹽水+血根堿組間Hela/DDP細(xì)胞生長抑制率比較無顯著性差異（P＞0.05）。

圖4 轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1對血根堿誘導(dǎo)Hela/DDP細(xì)胞增殖的影響Figure 4 Effect of TGF-β1 on the proliferation of sanguinarine-induced Hela/DDP cells

2.5 TGF-β1緩解了血根堿誘導(dǎo)Hela/DDP細(xì)胞的TGF-β/Smad信號失活 此外，TGF-β1還逆轉(zhuǎn)了血根堿所誘導(dǎo)的Hela/DDP細(xì)胞Smad2磷酸化和p15的表達(dá)抑制。圖5結(jié)果顯示，TGF-β1+血根堿組Hela/DDP細(xì)胞TGF-β1、p-Smad2/Smad2和p15的蛋白表達(dá)水平明顯高于生理鹽水+血根堿組（P＜0.05），表明TGF-β1可以緩解血根堿誘導(dǎo)Hela/DDP細(xì)胞的TGF-β1/Smad信號失活。

圖5 轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1對血根堿誘導(dǎo)Hela/DDP細(xì)胞TGF-β1、p-Smad2/Smad2和p15蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effects of TGF-β1 on protein expressions of TGF-β1，p-Smad2/Smad2 and p15 in sanguinarineinduced Hela/DDP cells

3 討論

順鉑（DDP）對晚期或復(fù)發(fā)性宮頸癌治療最為有效[16]。越來越多的證據(jù)表明，靶向線粒體、誘導(dǎo)DNA損傷進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡是DDP化療治療宮頸癌的主要作用[17-18]。然而，基于DDP化療的內(nèi)在或獲得性耐藥已成為許多癌癥治療中的挑戰(zhàn)。血根堿具有良好的抗腫瘤活性，本研究發(fā)現(xiàn)，2μmol/L血根堿顯著降低了HeLa/DDP細(xì)胞的增殖。

TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤的發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。TGF-β超家族信號通路調(diào)控著復(fù)雜的基因表達(dá)反應(yīng)，并因不同生理和病理環(huán)境而變化，其在多個水平上廣泛地調(diào)節(jié)維持體內(nèi)平衡。TGF-β信號通過與膜上特異性受體結(jié)合發(fā)生信號級聯(lián)反應(yīng)，依次激活并磷酸化胞內(nèi)Smad蛋白形成TGF-β/Smad復(fù)合物，隨后移入細(xì)胞核調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。調(diào)節(jié)過程中任何信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子發(fā)生異常都可導(dǎo)致或促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[19-20]。有研究表明，TGF-β1與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[21]。Smad2蛋白在宮頸癌組織中表達(dá)減少，與宮頸癌浸潤程度、癌細(xì)胞分化程度密切相關(guān)[22-23]。p15基因是腫瘤抑制基因的候選基因，受細(xì)胞生長抑制蛋白TGF-β1的誘導(dǎo)，對細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用[24]。TGF-β1可調(diào)節(jié)周期蛋白復(fù)合物的活性并通過抗增殖機(jī)制直接誘導(dǎo)p15基因轉(zhuǎn)錄，對于細(xì)胞周期從G1期向S期進(jìn)化的關(guān)鍵過程至關(guān)重要[25]。TGF-β1調(diào)節(jié)p15基因的表達(dá)，Smad2與Sp1合作誘導(dǎo)p15轉(zhuǎn)錄以響應(yīng)TGF-β1[26]。本研究結(jié)果顯示，血根堿可以明顯抑制HeLa/DDP細(xì)胞TGF-β1、p-Smad/Smad和p15的蛋白表達(dá)。本研究中拯救實(shí)驗(yàn)還驗(yàn)證了血根堿對TGF-β1/Smad信號通路的調(diào)控作用，認(rèn)為血根堿抑制HeLa/DDP細(xì)胞的增殖可能是通過TGF-β1/Smad信號通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，血根堿可抑制HeLa/DDP細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad信號通路有關(guān)。