張永占，張寧，尚紅濤，劉子豪，王燚煒

（1.秦皇島市第一醫(yī)院，河北秦皇島 066600；2.衡水市人民醫(yī)院，河北衡水 053000）

肱骨骨折是由車禍、擠壓、手或肘部直接接觸地面等直接或間接暴力所導致的一種骨科常見疾病[1]。該病致傷原因復雜，極易伴隨血管及神經(jīng)等損傷，且骨折愈合本身是一個復雜且相對漫長的生物學過程，臨床常見骨折延遲愈合或不愈合[2]。因此，如何縮短骨折愈合時間、促進骨折愈合、減少骨折延遲愈合及不愈合等情況一直是骨科亟待解決的問題。中醫(yī)學在加速促進骨折愈合方面具有獨特的優(yōu)勢。中醫(yī)學認為，骨折愈合是“瘀去、新生、骨合”循序漸進的過程，即“血不活則瘀不能去，瘀不去則骨不能接”[3-5]。本院自制散瘀止痛續(xù)骨方，具有散瘀、接骨、止痛的功效，臨床治療骨折取得了良好的療效；但其具體作用機制尚不明確。已有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt3a/低密度脂蛋白受體相關蛋白5（low density lipoprotein receptor-associated protein 5，Lrp5）信號通路在骨形成中發(fā)揮著重要的作用，其可通過促進成骨細胞形成、抑制破骨細胞骨吸收促進骨重建，有效改善骨損傷[6]。因此，本研究基于Wnt3a/Lrp5信號通路探討散瘀止痛續(xù)骨方對肱骨骨折大鼠的治療機制，以期為其臨床應用治療骨折提供實驗基礎，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只SPF級雄性SD大鼠，體質量200～250 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2020-0018。大鼠單籠喂養(yǎng)，12 h/12 h晝夜交替，在常溫下無菌自由進食、飲水。適應性喂養(yǎng)2周后，按照《實驗動物管理條例》進行實驗。

1.2 藥物、試劑與儀器 散瘀止痛續(xù)骨方由乳香8 g、沒藥8 g、地鱉蟲10 g、赤芍15 g、川芎10 g、桂枝8 g、延胡索10 g、木香8 g、枳殼6 g、羌活6 g、防風6 g、骨碎補12 g、續(xù)斷12 g、澤瀉10 g、車前子8 g、白術10 g、熟地6 g、當歸6 g、黨參10 g、黃芪20 g、甘草6 g組成，所有中藥材均購自秦皇島市第一醫(yī)院中藥房。辛伐他汀片（北京伊塔生物科技有限公司，批號：YT1963）。生理鹽水（北京伊塔生物科技有限公司，批號：YT3740）；蘇木素染液（美國Sigma公司）；伊紅染液（上海吉至生化科技有限公司）；十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰氨凝膠電泳（PAGE）試劑盒（凱基生物科技發(fā)展有限公司）；Wnt3a抗體（艾美捷科技有限公司）；Lrp5抗體（武漢菲恩生物科技有限公司）；GAPDH抗體（美國Proteintech公司）?？耸厢槪ê幽蠞稍t(yī)療器械銷售有限公司）；骨鉗（南京卡爾文生物科技有限公司）；CX-60光學顯微鏡（日本Olympus公司）；KUBTEC XRAY-DXA雙能X線骨密度儀[博卓生物科技（上海）有限公司]；KW-GU小動物骨骼強度測定儀（南京卡爾文生物科技有限公司）。

1.3 分組、造模與給藥 將40只大鼠隨機分為正常組、模型組、辛伐他汀組、散瘀止痛續(xù)骨方組，每組10只。模型組、辛伐他汀組、散瘀止痛續(xù)骨方組大鼠構建肱骨骨折模型。方法：麻醉大鼠后，將其仰臥位固定，消毒后充分暴露出肱骨骨干及肱骨內外髁，將1 mm克氏針逆行向上鉆入肱骨髓腔，穿出皮膚后剪除多余針頭尾端，用骨鉗截斷肱骨上1/3處以造成橫行骨折?；盍Φ鉀_洗后在骨折周圍滴入慶大霉素3滴，逐層縫合傷口，術畢給予肌肉注射50 mg/kg青霉素，連續(xù)3 d。正常組不做任何處理。建模成功后，散瘀止痛續(xù)骨方組給予灌胃1.5 mg·kg-1·d-1散瘀止痛續(xù)骨方水煎液（按中藥常規(guī)煎煮方法），辛伐他汀組給予20.0 mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃，正常組、模型組同期給予同體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)21 d。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 X線攝片 給藥結束后，麻醉大鼠，固定，對患肢行X線攝片檢查，觀察大鼠骨折的愈合情況。

1.4.2 大鼠肱骨骨密度測定 應用雙能X線骨密度儀測量肱骨整體骨密度（total bone mineral density，tBMD）、近端（近端上1/4）骨密度（proximal bone mineral density，pBMD）、中段（中1/2）骨密度（middle bone mineral density，mBMD）、遠端（下1/4）骨密度（distal bone mineral density，dBMD）。

1.4.3 大鼠肱骨骨強度測定 應用小動物骨骼強度測定儀檢測大鼠肱骨骨強度。

1.4.4 蘇木素-伊紅染色法觀察大鼠肱骨組織病理形態(tài) 處死大鼠，迅速游離出肱骨，洗凈后，進行脫鈣、梯度乙醇脫水、二甲苯透明2次處理，然后進行石蠟包埋、切片。脫蠟后，進行常規(guī)HE染色，梯度乙醇及二甲苯脫水，透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察肱骨組織病理學改變。

1.4.5 Western Blot法檢測大鼠肱骨組織中Wnt3a/Lrp5蛋白表達 取肱骨組織清洗、剪碎，加入放射免疫吸附分析（RIPA）裂解液研磨成勻漿，在冰上充分裂解10 min后，4℃離心取上清液，二喹啉甲酸（BCA）法進行蛋白定量。沸水浴3 min并冷卻后，進行電泳，再用半干法將凝膠上蛋白轉移至甲醇活化的聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。胎牛血清封閉2 h，分別加入稀釋的Wnt3a、Lrp5、GAPDH等一抗（體積比1∶1 000）4℃搖床振蕩孵育過夜。次日，PBS洗滌3次，加入稀釋的二抗（體積比1∶5 000）室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，用增強化學發(fā)光（ECL）試劑顯影，曝光。應用ImageJ軟件分析灰度值，結果以目的蛋白與內參GAPDH灰度值比值表示。

1.5 統(tǒng)計方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用t檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肱骨X線攝片結果比較 圖1結果顯示：與正常組比較，模型組可見明顯骨折線，僅有少量骨痂生長且排列疏松；與模型組比較，辛伐他汀組、散瘀止痛續(xù)骨方組骨折線逐漸消失，骨痂明顯增多且排列規(guī)則緊密，骨密度明顯升高，且散瘀止痛續(xù)骨方組較辛伐他汀組改善明顯。

圖1 各組大鼠肱骨X線片表現(xiàn)Figure 1 X-ray findings of humerus in each group of rats

2.2 各組大鼠肱骨骨密度比較 表1結果顯示：與正常組比較，模型組各段肱骨骨密度顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組、散瘀止痛續(xù)骨方組各段肱骨骨密度顯著升高（P＜0.05），且散瘀止痛續(xù)骨方組升高作用優(yōu)于辛伐他汀組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠肱骨骨密度比較Table 1 Comparison of humeralbone mineraldensity among various groups of rats （±s，g·cm-2）

表1 各組大鼠肱骨骨密度比較Table 1 Comparison of humeralbone mineraldensity among various groups of rats （±s，g·cm-2）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與辛伐他汀組比較

組別正常組模型組辛伐他汀組散瘀止痛續(xù)骨方組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 tBMD 0.211±0.01 0.156±0.01①0.178±0.02①②0.199±0.02①②③12.300＜0.001 pBMD 0.213±0.02 0.154±0.01①0.176±0.01①②0.199±0.03①②③8.344＜0.001 mBMD 0.212±0.01 0.155±0.02①0.176±0.03①②0.198±0.01①②③8.061＜0.001 dBMD 0.211±0.03 0.155±0.02①0.177±0.02①②0.201±0.01①②③4.912＜0.001

2.3 各組大鼠肱骨骨強度比較 圖2結果顯示：與正常組比較，模型組肱骨骨強度顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組、散瘀止痛續(xù)骨方組肱骨骨強度均顯著升高（P＜0.05），且散瘀止痛續(xù)骨方組升高作用優(yōu)于辛伐他汀組（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠肱骨骨強度比較（±s）Figure 2 Comparison of humeral bone strength among various groups of rats（±s）

2.4 各組大鼠肱骨骨折部位病理組織學特征比較 圖3結果顯示：正常組大鼠肱骨組織形態(tài)完整，骨小梁致密，骨髓腔大小正常，且可見成骨細胞；模型組骨組織形態(tài)遭到破壞，骨外膜內層明顯增厚，出現(xiàn)明顯充血現(xiàn)象，并可見大量炎性細胞浸潤及少量纖維組織；辛伐他汀組、散瘀止痛續(xù)骨方組可見大量肉芽組織生長和新生毛細血管及軟骨組織等，并出現(xiàn)大量骨痂及纖維組織，同時可見大量成骨細胞增生活躍，骨小梁間的空隙逐漸被新骨充滿。

圖3 各組大鼠肱骨骨折部位病理組織學特征比較（HE染色，×400）Figure 3 Comparison of histopathologicalcharacteristics of humeralfracture sites among various groups of rats（by HE staining，×400）

2.5 各組大鼠肱骨組織Wnt3a、Lrp5蛋白表達比較 圖4結果顯示：與正常組比較，模型組肱骨組織Wnt3a、Lrp5蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組、散瘀止痛續(xù)骨方組肱骨組織Wnt3a、Lrp5蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），且散瘀止痛續(xù)骨方組升高作用優(yōu)于辛伐他汀組（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠肱骨組織Wnt3a、Lrp5蛋白表達比較Figure 4 Comparison of protein expression of Wnt3a，Lrp5 among various groups of rats

3 討論

良好的血供是促使骨折愈合的首要條件[7-8]。本研究X線攝片結果顯示，散瘀止痛續(xù)骨方組大鼠骨折線逐漸消失，骨痂明顯增多且排列規(guī)則緊密。病理組織學特征結果顯示，散瘀止痛續(xù)骨方組大鼠肱骨骨折部位新生大量肉芽組織、毛細血管及軟骨組織，出現(xiàn)大量骨痂及纖維組織，同時可見大量成骨細胞增生，骨小梁間的空隙被新骨充滿。表明散瘀止痛續(xù)骨方可顯著促進骨折愈合，對肱骨骨折大鼠具有顯著的療效。提示散瘀止痛續(xù)骨方可能通過活血化瘀、通經(jīng)活絡、祛瘀生新等功效，起到擴張血管及促進血管生成的作用，進而有效改善血液循環(huán)、增強機體清除血腫的能力、增強血供，從而達到改善軟組織損傷、抑制骨吸收，促進骨折的成骨等目的，最終有效促進骨折愈合。

骨密度及骨強度是反映骨質量及預測骨折危險性的2項重要指標，同時也與內環(huán)境的穩(wěn)定性密切相關，其在判斷及研究骨骼生理、病理及診斷全身各種疾病等方面均占有重要地位[9]。提高骨質量及骨的生物力學性能是骨折治療的主要作用機制[10]。本研究結果表明，散瘀止痛續(xù)骨方可顯著提高肱骨骨折大鼠骨密度及骨強度。提示散瘀止痛續(xù)骨方可能通過生新續(xù)損、接骨續(xù)筋等功效來促進骨吸收與骨形成之間的偶聯(lián)作用，促進骨痂形成，進而有效促進骨形成及骨重建，并改善骨生物力學。

骨骼的生長、發(fā)育和代謝需要骨髓間充質干細胞、軟骨細胞、成骨細胞、破骨細胞等相互協(xié)調作用，一旦其之間的動態(tài)平衡被破壞就會導致骨結構的異常，而骨折愈合過程就是恢復這一動態(tài)平衡的過程。孫欣欣[11]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt3a/Lrp5信號傳導通路能夠通過調節(jié)成骨細胞增殖、分化兩方面影響骨髓間充質干細胞向成骨細胞的轉變，從而影響骨質的形成。有研究表明，Wnt3a可抑制骨髓間充質干細胞向軟骨細胞分化來參與骨形成[12-13]，而Lrp5可作為Wnt蛋白的跨膜受體通過促進成骨細胞功能來影響骨量的積累[14]。本研究結果顯示，與模型組比較，散瘀止痛續(xù)骨方組肱骨組織Wnt3a、Lrp5蛋白表達顯著升高，表明散瘀止痛續(xù)骨方可有效激活Wnt3a、Lrp5信號通路。提示散瘀止痛續(xù)骨方可能是通過激活Wnt3a、Lrp5信號通路，進而達到刺激骨細胞增殖分化、增加成骨細胞活性及膠原合成、抑制破骨細胞骨吸收、增加骨基質等的目的，從而促進骨折的愈合。

綜上所述，散瘀止痛續(xù)骨方可有效地促進骨折大鼠骨愈合，其作用機制可能與激活Wnt3a/Lrp5信號通路有關，且療效作用優(yōu)于辛伐他汀。