王錦淼，王穎，周博昊，王雷，穆偉斌

1 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161003；2 常熟理工學(xué)院計(jì)算機(jī)科學(xué)與工程學(xué)院

癌癥已經(jīng)成為全球主要死亡原因之一［1-2］。癌癥是一種由體細(xì)胞突變和克隆選擇導(dǎo)致的細(xì)胞惡性增殖的基因疾病，可直接導(dǎo)致癌癥發(fā)生的基突變即為“驅(qū)動(dòng)突變”［3］，而不會(huì)造成癌細(xì)胞增殖的無直接影響基突變則為“乘客突變”，“乘客突變”對(duì)癌癥的驅(qū)動(dòng)作用很?。?］，因此，識(shí)別出對(duì)癌癥具有重要影響的“驅(qū)動(dòng)基因”是目前癌癥發(fā)生機(jī)制的研究重點(diǎn)［5-6］，包含驅(qū)動(dòng)突變的基因則為“癌癥驅(qū)動(dòng)基因（Cancer Driver Genes，CDGs）”。CDGs可為癌癥預(yù)防、診斷和精準(zhǔn)治療提供關(guān)鍵信息［7］。結(jié)直腸癌（Colorectal carcinoma，CRC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升［8］。CRC 的發(fā)病與多種因素相關(guān)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)展，多組學(xué)基因檢測(cè)技術(shù)得到快速發(fā)展，但檢測(cè)常產(chǎn)生成千上萬CRC 相關(guān)基因，無法識(shí)別CRC的CDGs［9-11］。2021年6月起，我們采用多組學(xué)數(shù)據(jù)的組合優(yōu)化方法，篩選CRC 的關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因（Cancer Driver Genes，CDGs），并分析其生物學(xué)功能?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 CRC 基因數(shù)據(jù)和基因表達(dá)數(shù)據(jù)的下載及預(yù)處理 從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//cancergenome. nih. gov/）中搜索并下載CRC 基因［13］，一共獲得612 份樣本轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)，其中CRC 患者568 例、正常人44 例，癌基因56 753 個(gè)。從國際腫瘤基因組協(xié)作組數(shù)據(jù)庫

（the International Cancer Genome Consortium，ICGC）

（https：//dcc. icgc. org/）中搜索并下載CRC 基因表達(dá)數(shù)據(jù)［14］，一共獲得548 份數(shù)據(jù)，癌基因20 888 個(gè)。對(duì)下載的數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，剔除異常值數(shù)據(jù)，去除信息不全、重復(fù)和可能存在錯(cuò)誤的樣本和突變頻率過高或過低基因［15］，提高數(shù)據(jù)可靠性、準(zhǔn)確性。

1.2 CRC的關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因篩選

1.2.1 構(gòu)建CRC 基因突變矩陣與CRC 突變基因表達(dá)矩陣 從基因芯片中提取出樣本原始突變基因和表達(dá)基因，運(yùn)用“python”軟件將數(shù)據(jù)整理為基因-樣本形式的矩陣，將其分為癌癥組和對(duì)照組，將CRC突變基因數(shù)據(jù)整理成突變矩陣（CRC 基因突變矩陣），將突變基因表達(dá)數(shù)據(jù)構(gòu)建成基因表達(dá)矩陣（CRC突變基因表達(dá)）。

1.2.2 構(gòu)建CRC 高維突變基因加權(quán)網(wǎng)絡(luò)模型 從STRING 數(shù)據(jù)庫（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes）［17］中獲取CRC 基因的蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用python 軟件將CRC 基因突變矩陣、CRC突變基因表達(dá)矩陣和PPI數(shù)據(jù)整合交集，以突變基因和PPI 網(wǎng)絡(luò)的score 值分別作為節(jié)點(diǎn)和邊，score值代表了基因之間這種相互作用（既包括蛋白質(zhì)之間直接的物理的相互作用，也包括蛋白質(zhì)間連接功能的相關(guān)性），節(jié)點(diǎn)屬性為突變因子分?jǐn)?shù)，兩者結(jié)合建立高維突變基因加權(quán)網(wǎng)絡(luò)，共包含14 388個(gè)基因。

1.2.3 CRC 癌癥驅(qū)動(dòng)基因篩選 根據(jù)高維突變基因加權(quán)網(wǎng)絡(luò)模型的結(jié)構(gòu)特征，通過每個(gè)基因在網(wǎng)絡(luò)中相鄰基因的突變影響，計(jì)算最大基因影響分?jǐn)?shù)，基因節(jié)點(diǎn)影響分?jǐn)?shù)最大值即基因最大突變影響分?jǐn)?shù)得分，根據(jù)基因最大突變影響分?jǐn)?shù)得分最終得到CRC癌癥驅(qū)動(dòng)基因。

1.2.4 CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因篩選 CGC（The Cancer Gene Census）［19］數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)址為：https：//cancer. sanger. ac. uk/census，其收錄基因是已被醫(yī)學(xué)界和生物界所認(rèn)定與癌癥相關(guān)的驅(qū)動(dòng)基因。從CGC 數(shù)據(jù)中提取已經(jīng)證實(shí)的結(jié)直腸癌癥基因［20-21］與“1.2.3”得到CRC 癌癥驅(qū)動(dòng)基因比較，得到CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因。

1.3 CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的生物學(xué)功能分析 采用STRING（https：//string-db. org）數(shù)據(jù)庫構(gòu)建CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），互動(dòng)分?jǐn)?shù)設(shè)置為中等置信度0.4 分，該圖由節(jié)點(diǎn)和邊組成，節(jié)點(diǎn)代表蛋白，邊代表關(guān)系，不同的顏色代表不同的數(shù)據(jù)來源。利用STRING在線分析工具生物注釋將排名前100的顯著差異基因進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）分析和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號(hào)通路富集分析。GO 功能富集分析是對(duì)基因進(jìn)行注釋和生物學(xué)功能分析的重要工具，Go 功能主要分成三大類：生物學(xué)過程（BP）、分子功能（MF）和CC細(xì)胞組成（CC），KEGG 信號(hào)通路富集分析可從大規(guī)模分子數(shù)據(jù)集中了解基因的富集通路。

2 結(jié)果

2.1 CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因 最終篩選出22 個(gè)CRC關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因，其中排名前20分別為ATM、TTN、PCDHGB3、LRP1B、PCDHA6、PIK3CA、SYNE1、PCDHGB2、KMT2C、BRAF、BMPR1A、PCDHGA8、PCDHGA5、FAT4、PCDHA8、APC、PCDHGA7、PCDHA10、PCDHA9 及FBXW7。基因最大突變影響分?jǐn)?shù)得分分別為37 146.55、37 146.55、34 319.47、33 546.18、33 546.18、32 235.49、32 008.97、31 207.03、30 492.44、30 362.73、30 340.14、29 289.54、29 289.54、28 121.02、26 733.33、23 042.20、21 811.26、20 764.04、20 764.04、20 394.35。CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的相互作用圖見圖1。

圖1 CRC關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的相互作用圖

2.2 CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的生物學(xué)功能 CRC關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)包含100 個(gè)節(jié)點(diǎn)，241條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為4.82，局部聚類系數(shù)為0.474，PPI 富集P值＜1.0e-16。GO 功能富集結(jié)果顯示，CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的分子功能主要集中在鈣離子結(jié)合、陽離子結(jié)合、金屬離子結(jié)合、離子結(jié)合、捆綁、β-連環(huán)蛋白結(jié)合、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性（h3-k4特異性）等；生物過程主要集中在通過質(zhì)膜黏附分子的同源性細(xì)胞黏附、通過質(zhì)膜黏附分子的細(xì)胞-細(xì)胞黏附、細(xì)胞黏附、細(xì)胞間黏附、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、解剖結(jié)構(gòu)發(fā)展、心臟發(fā)育、系統(tǒng)開發(fā)、多細(xì)胞生物發(fā)育、解剖結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生等；細(xì)胞組成主要集中在質(zhì)膜、質(zhì)膜的組成部分、膜、肌原纖維、肌膜、肌節(jié)、膜的組成部分、質(zhì)膜有界細(xì)胞投射、肌原纖維附著點(diǎn)、超分子纖維等。

KEEG 信號(hào)通路富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的信號(hào)通路主要集中在大腸癌、子宮內(nèi)膜癌、肝細(xì)胞癌、慢性粒細(xì)胞白血病、FoxO 信號(hào)通路、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號(hào)通路、胃癌、前列腺癌、乙型肝炎、癌癥中的微小RNA。

3 討論

癌癥的發(fā)生和發(fā)展與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、表觀組學(xué)及代謝組學(xué)等多組學(xué)數(shù)據(jù)息息相關(guān)［12］。以往通常是在單個(gè)的大樣本數(shù)據(jù)中找到一些突變率顯著很高的基因作為候選基因，這樣的篩選造成癌癥通路中存在基因之間強(qiáng)異質(zhì)性的問題，所以如果單純的對(duì)其中一種組學(xué)數(shù)據(jù)來進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘和生物研究會(huì)存在明顯的不足與缺陷，那么通過整合多組學(xué)數(shù)據(jù)并進(jìn)行綜合分析對(duì)癌癥得到了更深層次和更全面的探索，利用生物信息學(xué)技術(shù)鑒定出關(guān)鍵基因及其相關(guān)通路，從病理發(fā)生的分子機(jī)制角度對(duì)CRC 進(jìn)行理解，找到潛在可深入研究的用于診斷生物標(biāo)志物以及治療CRC的分子八項(xiàng)標(biāo)志物。

本研究采用多組學(xué)數(shù)據(jù)的組合優(yōu)化方法，整合體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)、基因表達(dá)數(shù)據(jù)以及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)三種組學(xué)數(shù)據(jù)。首先基于多統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的CDGs生物特征提取，計(jì)算基因突變因子和皮爾遜相關(guān)系數(shù)，分別構(gòu)建出突變矩陣和基因表達(dá)矩陣。然后以基因的突變頻率和基因表達(dá)水平相關(guān)性為節(jié)點(diǎn)和邊，建立高維突變基因加權(quán)網(wǎng)絡(luò)模型，基于該網(wǎng)絡(luò)模型利用重力學(xué)模型計(jì)算基因與鄰居節(jié)點(diǎn)的突變影響分?jǐn)?shù)，根據(jù)節(jié)點(diǎn)的影響分?jǐn)?shù)最大值進(jìn)而得出基因的突變影響因子大小，并在兼顧基因網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的條件下，以突變影響因子大小為根據(jù)運(yùn)用一種綜合的基因打分方法，最終得出驅(qū)動(dòng)基因的預(yù)測(cè)集。

本研究中構(gòu)建的基因相互作用網(wǎng)絡(luò)信息更加全面，對(duì)于以往單一組學(xué)數(shù)據(jù)研究的缺陷進(jìn)行了彌補(bǔ)，在多個(gè)體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)集上進(jìn)行評(píng)估，優(yōu)先選擇潛在的癌癥驅(qū)動(dòng)基因，對(duì)識(shí)別出的驅(qū)動(dòng)基因進(jìn)行CGC富集對(duì)比分析并能很好富集到CGC 列表中，利用本方法識(shí)別出的CRC排名靠前出現(xiàn)在CGC基因列表中的 前10 個(gè) 包 括：ATM、TTN、PCDHGB3、LRP1B、PCDHA6、PIK3CA、SYNE1、PCDHGB2、KMT2C 和BRAF，在CRC 組織中均明顯表達(dá)增高，說明了這10個(gè)基因均與癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這些關(guān)鍵基因可以作為CRC診斷和治療的潛在靶標(biāo)，也使我們更加全面的了解CRC的發(fā)病機(jī)制和發(fā)展機(jī)理，對(duì)于CRC的預(yù)防和早期診斷、治療具有重要的臨床意義。

對(duì)CRC 的關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因進(jìn)行GO 本體論分析和KEGG 通路生物功能分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRC關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的分子功能主要集中在鈣離子結(jié)合、陽離子結(jié)合、金屬離子結(jié)合、離子結(jié)合、捆綁、β-連環(huán)蛋白結(jié)合、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性（h3-k4 特異性）等；生物過程主要集中在通過質(zhì)膜黏附分子的同源性細(xì)胞黏附、通過質(zhì)膜黏附分子的細(xì)胞-細(xì)胞黏附、細(xì)胞黏附、細(xì)胞間黏附、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、解剖結(jié)構(gòu)發(fā)展、心臟發(fā)育、系統(tǒng)開發(fā)、多細(xì)胞生物發(fā)育、解剖結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生等；細(xì)胞組成主要集中在質(zhì)膜、質(zhì)膜的組成部分、膜、肌原纖維、肌膜、肌節(jié)、膜的組成部分、質(zhì)膜有界細(xì)胞投射、肌原纖維附著點(diǎn)、超分子纖維等。驅(qū)動(dòng)基因都是與質(zhì)膜、肌膜和離子結(jié)合炎癥等生命正常運(yùn)行時(shí)有密切關(guān)聯(lián)的，說明這些驅(qū)動(dòng)基因具有重要的生物學(xué)功能。對(duì)KEGG 信號(hào)通路與關(guān)鍵基因關(guān)聯(lián)的分析，本研究中CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的信號(hào)通路主要集中在大腸癌、子宮內(nèi)膜癌、肝細(xì)胞癌、慢性粒細(xì)胞白血病、FoxO信號(hào)通路、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號(hào)通路、胃癌、前列腺癌、乙型肝炎、癌癥中的微小RNA，說明CRC 關(guān)鍵基因的基因調(diào)控通路可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)同一驅(qū)動(dòng)基因在不同腫瘤之間產(chǎn)生致癌作用，說明癌癥的發(fā)病存在共通之處。

綜上所述，成功篩選出22個(gè)CRC關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因，如ATM、TTN、PCDHGB3等。CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的分子功能主要集中在鈣離子結(jié)合、陽離子結(jié)合、金屬離子結(jié)合等；生物過程主要集中在通過質(zhì)膜黏附分子的同源性細(xì)胞黏附、通過質(zhì)膜黏附分子的細(xì)胞-細(xì)胞黏附、細(xì)胞黏附等；細(xì)胞組成主要集中在質(zhì)膜、質(zhì)膜的組成部分、膜等；信號(hào)通路主要集中在大腸癌、FoxO 信號(hào)通路、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號(hào)通路等。深入了解CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因有助于研究CRC 發(fā)生發(fā)展機(jī)制，同時(shí)可為CRC 提供新的治療靶點(diǎn)。同時(shí)，多組學(xué)數(shù)據(jù)分析方法能夠高精度預(yù)測(cè)疾病的驅(qū)動(dòng)基因，為其他癌癥的診療研究提供了一種新方法。