張小燕 高靜賢 那成龍 趙鵬程

1 江蘇省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所 （江蘇 南京 210019）

2 南京世和醫(yī)療器械有限公司 （江蘇 南京 210012）

內(nèi)容提要： 目的：對(duì)4種新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒的性能包括敏感性與特異性、最低檢出限、精密度和分析特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為實(shí)驗(yàn)室選擇新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒提供參考，促進(jìn)新冠肺炎病毒核酸檢測(cè)技術(shù)的創(chuàng)新改進(jìn)。方法：以20例新冠病毒確診陽性和10例確診陰性的咽拭子作為研究樣本，經(jīng)提取得到RNA后根據(jù)4種新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒說明書對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，分析擴(kuò)增結(jié)果，評(píng)估各試劑盒的差異。結(jié)果：檢測(cè)結(jié)果顯示4種試劑盒對(duì)30例研究樣本的陰陽性判定情況不盡相同，其中a試劑盒的敏感性和特異性最高，均達(dá)到100%；3例陽性樣本稀釋到100倍時(shí)，c試劑盒只能檢出其中的1例，而其他三種試劑盒能檢出其中的2例，表明c試劑盒的檢測(cè)敏感性低于其他三種；4種試劑盒在精密度實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)樣本得到的Ct值的CV值都較接近，且都＜10%；加入了8種常見的高濃度干擾物質(zhì)的臨界陽性樣本經(jīng)4種試劑盒檢測(cè)，結(jié)果依然為弱陽性，說明無干擾；4種試劑盒檢測(cè)5例含非目標(biāo)病毒的臨床樣本，檢測(cè)結(jié)果為陰性，即未發(fā)生交叉反應(yīng)。結(jié)論：新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)低濃度核酸樣本的檢測(cè)能力有所差異，各試劑盒不同的檢出限也造成了總體上的敏感性和特異性的差異，實(shí)驗(yàn)室在選擇新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒時(shí)可以對(duì)其進(jìn)行性能驗(yàn)證，以保證選到最合適的試劑盒。

嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus，SARS-CoV-2）為新型冠狀病毒肺炎疫情的病原體，該病毒主要通過口鼻分泌物傳播，包括咳嗽、打噴嚏和說話產(chǎn)生的呼吸道飛沫，感染該病毒者常見的癥狀包括發(fā)熱、咳嗽、疲勞、呼吸急促、味嗅覺喪失[1-3]。SARS-CoV-2是一種具有包膜的、不分節(jié)段的正鏈單股RNA病毒，顆粒呈圓形或橢圓形，直徑約80～120nm，包含有核酸及核衣殼蛋白，有三種主要蛋白：包膜蛋白（E蛋白）、膜蛋白（M蛋白）和刺突蛋白（S蛋白）[4,5]。經(jīng)研究，SARS-CoV-2感染機(jī)制是：在接觸宿主細(xì)胞時(shí)，病毒的S蛋白會(huì)經(jīng)歷特定的構(gòu)象變化，使之RBD區(qū)域暴露后與hACE2相結(jié)合，接著通過促進(jìn)S2蛋白介導(dǎo)與細(xì)胞的膜融合完成感染的全過程[6-8]。

在國(guó)家衛(wèi)生健康委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》中規(guī)定，實(shí)時(shí)熒光PCR（Real-Time PCR，RT-PCR）方法與基因組測(cè)序、新冠病毒特異性抗體檢測(cè)同被作為診斷標(biāo)準(zhǔn)。而以RT-PCR方法作為檢測(cè)技術(shù)的試劑盒是目前獲得醫(yī)療器械注冊(cè)證最多的新冠病毒檢測(cè)產(chǎn)品，作為主流檢測(cè)技術(shù)，RT-PCR相較于常規(guī)的抗原和抗體檢測(cè)，具有靈敏度和特異度高、不存在窗口期且不易被干擾的優(yōu)點(diǎn)；相較于宏基因組測(cè)序，具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短和花費(fèi)低的優(yōu)點(diǎn)。RT-PCR檢測(cè)新冠病毒核酸試劑盒針對(duì)的位點(diǎn)是其基因組的3端保守基因序列，及RdRp基因（位于ORF1ab）、N基因和E基因。《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南（第四版）》推薦對(duì)ORF1ab和N基因設(shè)計(jì)引物和探針進(jìn)行檢測(cè)。本文從產(chǎn)品的敏感性與特異性、最低檢出限和精密度三個(gè)方面對(duì)市場(chǎng)份額占比較大的4種熒光定量PCR法核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)，以期為各實(shí)驗(yàn)室選擇SARS-CoV-2檢測(cè)試劑盒時(shí)提供參考。

1.資料與方法

1.1 一般資料

實(shí)驗(yàn)起止時(shí)間：2022年1月～2022年2月。

樣本：收集20例新型冠狀病毒確診陽性患者（樣本編號(hào)為YS-1至YS-20）與10例確診陰性健康人的咽拭子（樣本編號(hào)為YS-21至YS-30）作為本次研究的樣本。

檢測(cè)試劑：提取試劑選用QIAGEN生產(chǎn)的QIAamp Viral RNA Mini Kit（52904），嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行提取。本研究中用到的4種試劑盒的信息見表1。

表1. 4種新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒基本信息

檢測(cè)儀器：ABI 7500熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取

嚴(yán)格按照QIAamp Viral RNA Mini Kit的說明書對(duì)30例咽拭子提取后，使用Qubit 4.0測(cè)量核酸濃度，使用NanoDrop One紫外/可見分光光度計(jì)測(cè)量A260/A280比值。

1.2.2 敏感性與特異性

敏感性和特異性是在醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)里評(píng)定一個(gè)診斷指標(biāo)時(shí)最基本的兩個(gè)特征，敏感性即在金標(biāo)準(zhǔn)判斷陽性人群中，檢測(cè)出陽性的概率，是代表真陽性率，敏感性越高意味著此種檢測(cè)方法的漏檢率越低；特異性即在金標(biāo)準(zhǔn)判斷陰性人群中，檢測(cè)出陰性的概率，是代表真陰性率，特異性越高意味著此種檢測(cè)方法的誤診率越低。嚴(yán)格按照4種試劑盒的說明書對(duì)20例新型冠狀病毒確診陽性患者與10例確診陰性健康人的咽拭子提取的RNA進(jìn)行檢測(cè)，記錄各個(gè)樣本的Ct值，從而進(jìn)行敏感性與特異性的計(jì)算。

1.2.3 最低檢測(cè)限

最低檢出限是指某一分析方法在給定的可靠程度內(nèi)可以從樣品中檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)的最小濃度或最小量，代表著此種方法的靈敏度。根據(jù)檢測(cè)的Ct值，選取3例不同陽性水平的樣本，分別進(jìn)行5倍、10倍、50倍和100倍稀釋（樣本編號(hào)1-5代表1號(hào)樣本稀釋5倍，以此類推），再用各個(gè)試劑盒對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，記錄結(jié)果比較各試劑盒的最低檢出限。

1.2.4 精密度

精密度用來表示檢測(cè)的再現(xiàn)性，可用來衡量體外診斷試劑批內(nèi)與批間、日內(nèi)與日間、室內(nèi)與室間等的變異程度。根據(jù)檢出限研究的檢測(cè)結(jié)果，使用健康人提取的RNA與新冠病毒確診陽性的患者RNA混合配制成中陽性水平樣品1例[編號(hào)為M（1）～M（16）]，弱陽性水平樣品[編號(hào)為L(zhǎng)（1）～L（16）]1例，再將幾例陰性RNA混合成陰性樣品[編號(hào)為N（1）～N（16）]1例，用三批試劑進(jìn)行批內(nèi)、批間、日間、人間、室間的精密度比較研究。安排兩個(gè)實(shí)驗(yàn)員使用三批次試劑在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室完成，每例樣本總共重復(fù)16次。

1.2.5 干擾研究

根據(jù)這些試劑盒所檢測(cè)樣本類型，針對(duì)可能存在的內(nèi)源性和外源性干擾物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，具體干擾物質(zhì)及其濃度見表2。本實(shí)驗(yàn)采用弱陽性水平樣本[樣本編號(hào)為L(zhǎng)（1）～L（8）]，將每種干擾物質(zhì)添加到樣本中使其成為潛在最大濃度，然后在此條件下進(jìn)行評(píng)價(jià)，見表2。

表2. 干擾物質(zhì)列表

1.2.6 交叉反應(yīng)

搜集含非目標(biāo)病毒但不含甲型流感病毒的臨床樣本，使用4種試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，考察目標(biāo)病毒（新型冠狀病毒）的檢測(cè)結(jié)果是否符合預(yù)期。總共收集了5例樣本，各樣本所含病毒信息見表3。

表3. 交叉反應(yīng)用樣本信息表

2.結(jié)果

2.1 敏感性、特異性

由表4可見，各試劑盒分別能檢出陽性樣本例數(shù)18～20例不等，導(dǎo)致敏感性為90%～100%不等，可見各試劑盒的敏感性差異不大，且均在90%以上。

表4. 用4種試劑盒檢測(cè)的20例咽拭子陽性樣本敏感性結(jié)果

由表5可見，在總共10例陰性樣本中，各試劑盒檢出陰性個(gè)數(shù)均為10例，特異性都較好。

表5. 用4種試劑盒檢測(cè)的10例咽拭子陰性樣本特異性結(jié)果

2.2 檢出限

將3例不同陽性水平的樣本分別稀釋后，用4種試劑盒進(jìn)行檢測(cè)得到結(jié)果見圖1，結(jié)果顯示a試劑盒的檢出限最低，靈敏度最高，反之，c試劑盒的檢出限最高，靈敏度最低。

圖1. 用4種試劑盒檢測(cè)不同陽性水平樣本的結(jié)果（Ct值）

2.3 精密度

為了比較這4種試劑盒在批內(nèi)與批間、日內(nèi)與日間、人間、室間的精密度，安排了2名實(shí)驗(yàn)員對(duì)3例樣本，每例樣本共計(jì)16次的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2、表6?？梢姴煌噭┖性?個(gè)方面的重復(fù)性的變異系數(shù)（CV%）有較大差異。

圖2. 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6. 變異系數(shù)-陰性樣本(CV%)

2.4 干擾研究

采用總共2種內(nèi)源性和6種常見外源性干擾物質(zhì)對(duì)弱陽性水平臨床樣本進(jìn)行干擾研究，結(jié)果（圖3）顯示，這8種干擾物質(zhì)在較高濃度下對(duì)4種試劑盒的檢測(cè)結(jié)果均無干擾。

圖3. 干擾研究結(jié)果

2.5 交叉反應(yīng)

4種試劑盒檢測(cè)5例含非目標(biāo)病毒但不含SARS-CoV-2的臨床樣本，結(jié)果均為陰性（-）。交叉反應(yīng)結(jié)果見表7。

表7. 交叉反應(yīng)結(jié)果

3.討論

由SARS-CoV-2引起的新冠肺炎仍在全球流行，快速準(zhǔn)確地診斷新冠病毒感染是這場(chǎng)疫情防控的關(guān)鍵。核酸檢測(cè)是SARS-CoV-2診斷的最主要方法，發(fā)揮著難以取代的作用，而實(shí)時(shí)熒光（RT-PCR）方法檢測(cè)新冠病毒的試劑盒是目前市場(chǎng)上最主流的產(chǎn)品，不同試劑盒之間的性能存在差異，決定了對(duì)樣本的檢出率和漏檢率的不同，因此性能驗(yàn)證對(duì)實(shí)驗(yàn)室選擇試劑盒顯得尤為重要。

在本研究中，對(duì)臨床上使用最多的熒光定量PCR法SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品進(jìn)行了性能比較，包含了敏感性與特異性、精密度、最低檢出限和分析特異性4個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。4種試劑盒的敏感性從90%～100%不等，結(jié)合最低檢出限驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可以得出造成敏感性不同的主要原因就是各試劑盒對(duì)低病毒載量樣本的檢測(cè)能力不同?？傮w來看，這4種試劑盒的檢出結(jié)果與臨床診斷結(jié)果接近，可以滿足臨床的使用需求，具有較高的臨床適應(yīng)性。