焦 健，沙小晶

（中國科學(xué)院科技戰(zhàn)略咨詢研究院，北京 100190）

一、作物miRNA 的生物信息學(xué)預(yù)測

利用生物信息學(xué)的途徑預(yù)測并發(fā)現(xiàn)新的miRNA 是一種有效方法，它以計算機程序分析為基礎(chǔ)、以給定的基因組序列為范圍，在動植物中鑒定出許多miRNA[1]。此方法可以鑒定那些表達量低或有時空表達特性的miRNA，利用miRNA 前體的二級結(jié)構(gòu)特征、熱力學(xué)穩(wěn)定性和物種間的相對保守性，尋找同源miRNA。

植物miRNA 的生物信息學(xué)預(yù)測方法有同源性比對、與靶標基因相結(jié)合、模式學(xué)習(xí)等方法[2]。同源性比對是根據(jù)同源miRNA在物種間的相對保守性和pre-miRNA 前體的結(jié)構(gòu)特征來搜索miRNA。利用miRNA 與其靶標基因可以發(fā)生堿基互補配對的特點，以及該配對方式也具有保守性，可以結(jié)合miRNA 的靶標基因，作為預(yù)測中的一個篩選條件，這種與靶標基因相結(jié)合來預(yù)測miRNA 的方法進一步提高了預(yù)測的準確性。模式學(xué)習(xí)是預(yù)先訓(xùn)練計算機程序?qū)σ阎栃詍iRNA 數(shù)據(jù)集和陰性miRNA 數(shù)據(jù)集的識別，進而對未知數(shù)據(jù)集進行分析的技術(shù)手段，該方法通過區(qū)分miRNA 和非miRNA 的天然特點，成為預(yù)測新miRNA 的一種途徑。

根據(jù)以上預(yù)測方法的基本原理，出現(xiàn)了系列miRNA 及其靶標基因的預(yù)測軟件，如：miRanda、DIANA-microT、RNAhybrid、TargetScan、MicroInspector、PicTar、TargetBoost、miTarget、RNA22 和microTar 等[3]。這些程序或預(yù)測軟件各有優(yōu)缺點，還需其他方法加以佐證才能真正鑒定新的miRNA。

二、作物miRNA 的高通量測序法

近年來，第二代測序法即高通量測序法被廣泛應(yīng)用于植物siRNA 或miRNA 的測序和鑒定，客觀上加快了siRNA 和miRNA研究進展，使大規(guī)?？寺RNA 并分析它們的功能成為可能。

高通量測序法具有高通量、高靈敏度、雜交特異性好等優(yōu)點。該方法首先需提取植物組織的Total RNA，用高密度聚丙烯酰胺凝膠電泳回收長度為18～30 nt 的sRNA，將得到的sRNA 5’和3’端加特異的接頭adaptor，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄和PCR 級聯(lián)擴增，建立富含18～30 nt的sRNA 文庫，再高通量上機測序得到大量初始數(shù)據(jù)。通過對這些初始數(shù)據(jù)的比對、分析和鑒定，可以獲得相當(dāng)可觀的信息。

目前，通過高通量測序法建立的miRNA 數(shù)據(jù)庫有：GEO（Gene Expression Ommibus）、miRBase、ASRP（Arabidopsis Small RNA Project）、Rfam、MPSS（Massively Parallel Signature Sequencing）和TarBase 數(shù)據(jù)庫等[4]。

三、作物miRNA 靶標基因的鑒定和研究

miRNA 靶標基因的鑒定并進而對其的功能分析，是研究miRNA 生物學(xué)功能的重要環(huán)節(jié)[5]。由于miRNA 可以與其靶標基因互補配對，因此，可以較方便的利用生物信息學(xué)方法，比對miRNA 所在的物種基因組全序列或部分ESTs 數(shù)據(jù)庫，就能對miRNA 的靶標基因進行初步預(yù)測。

初步預(yù)測得到的候選miRNA 靶標基因，還需通過其他試驗方法加以驗證，最終結(jié)合多種miRNA 靶標基因鑒定的方法，可以確定一個miRNA 的一個或多個靶標基因。其中，5’RACE 方法可以在轉(zhuǎn)錄水平鑒定miRNA 對其靶標基因的切割降解，通過5’RACE 卻不能擴增到的候選基因，即為miRNA 的靶標基因。

Western bloting 方法可以在翻譯水平鑒定miRNA 對其靶標基因翻譯的抑制，Western 雜交后目的蛋白條帶不清晰或沒有蛋白條帶的候選基因，即為miRNA 的靶標基因。

利用Northern bloting 方法可以檢測靶標基因的降解片段，從而在體外驗證miRNA 對靶標基因的切割降解。

通過對miRNA 靶標基因的預(yù)測和各種鑒定后，對其功能分析也可以間接證明內(nèi)源miRNA 的功能，因此，miRNA 靶標基因的鑒定和研究對分析miRNA 功能和作用具有重要意義[6]。

四、miRNA 研究案例

1、植株材料

大麥材料：I10；小麥材料：中國春；其他植株材料：本生煙、擬南芥、短柄草等。

2、載體和菌株

VIGS 相關(guān)的病毒載體包括：BSMV-LIC 載體（α,β 和γ 均為DNA 質(zhì)粒）。

表達載體包括：pGreen 載體，用于內(nèi)源siRNA 或miRNA 在本生煙中高表達。

克隆載體包括：pEASY-T、Gateway 相關(guān)載體。

大腸桿菌菌株包括：DH5α 和DH10B；農(nóng)桿菌菌株包括：GV3101 和EHA105。

3、BSMV pCaBS-γ-LIC 載體的構(gòu)建

用于內(nèi)源基因沉默：PCR 擴增目的片段時（最優(yōu)片段大小約為200-400bp），正向引物5’端需加LIC 接頭的序列為：5’-AAGGAAGTTTAA-3’，反向引物5’端需加LIC 接頭的序列為：5’-AACCACCACCACCGT-3’。

操作流程：PCR 擴增帶有LIC 接頭的目的片斷；將pCaBSγ-LIC 載體用ApaI 完全酶切，并依照以下流程將目的片段與載體用LIC 克隆方法連接：

若將攜帶amiRNA 的miRNA 前體序列插入BSMV pCaBS-γ-LIC載體，需要利用多重PCR，用amiRNA 和amiRNA*序列替換內(nèi)源的miRNA 和miRNA*序列，并保持原miRNA 前體二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)不變。

4、結(jié)果與分析

目前，越來越多的miRNA 通過測序或生物信息學(xué)預(yù)測的手段被報道，而僅有其中少數(shù)被研究透徹。通過表達和沉默miRNA是廣泛使用的反向遺傳學(xué)策略，為驗證BSMV 表達miRNA 前體而產(chǎn)生vamiRNA 或“與miRNA 序列相同的sRNA”（以vsiRNA表示）能否用于研究麥類作物內(nèi)源miRNA 的功能，可利用BSMV 病毒載體在麥類作物和模式植物短柄草中表達miRNA 前體以產(chǎn)生vsiRNA，或利用vamiRNA 沉默內(nèi)源miRNA。

（1）構(gòu)建基于BSMV 的vsiR_miRNA 表達載體

在大麥品種I10 中分別過表達HvuMIR164 和HuvMIR171 前體（以下用BSMV：vsiR_miR164 和BSMV：vsiR_miR171 表示），利用半定量End-point Stem-loop RT-PCR 檢測到內(nèi)源miR164 或miR171均有顯著上調(diào)，這可能是vsiR_miR164或vsiR_miR171高表達的結(jié)果。

（2）構(gòu)建基于BSMV 的miRNA 沉默載體

通過WMD3 平臺，設(shè)計靶向內(nèi)源miR164 和miR171 區(qū)域的amiRNAs 序列，即vamiR_miR164 和vamiR_miR171，再利用水稻OsaMIR528 前體作為骨架攜帶它們，通過BSMV 在I10 中表達（以下用BSMV：vamiR_miR164和BSMV：vamiR_miR171表示）。

半定量RT-PCR 檢測結(jié)果表明，BSMV：vamiR_miR164 或BSMV：vamiR_miR171 侵染的植株中，miR164 或miR171 的相對表達量顯著低于BSMV：EV 處理的植株，并且BSMV：vamiR_miR164 或BSMV：vamiR_miR171 侵染的植株中檢測到了vamiR_miR164 或vamiR_miR171 的高表達，而對照BSMV：EV 處理的植株未檢測到了vamiR_miR164 或vamiR_miR171 的表達。

結(jié)果說明，基于BSMV 的miRNA 前體或vamiRNA 的表達系統(tǒng)可在大麥中表達與miRNA 序列相同的sRNA（即vsiRNA）或沉默內(nèi)源miRNA，這為研究麥類作物內(nèi)源miRNA 的功能提供了一種研究手段。

（3）基于BSMV 的miRNA 表達或沉默在小麥和短柄草中的驗證

試驗進一步證明，BSMV 病毒載體也可以在普通小麥和模式植物短柄草中實現(xiàn)對內(nèi)源miRNA 的沉默或表達與miRNA序列相同的sRNA。QRT-PCR結(jié)合End-point Stem-loop技術(shù)檢測結(jié)果表明，與對照BSMV：EV 處理的植株相比，BSMV：vsiR_miR164 和BSMV：vsiR_miR171 處理后，大、小麥和短柄草vsiR_miR164 和vsiR_miR171 表達量顯著上升；而BSMV：vamiR_miR164 和BSMV：vamiR_miR171 處理后，大、小麥和短柄草內(nèi)源miR164 和miR171 表達量顯著下降。

半定量PCR 檢測BSMV 在大麥中高表達vsiR_miR164和vsiR_miR171。半定量PCR 檢測BSMV 在大麥中沉默內(nèi)源miR164 和miR171。QRT-PCR 檢測BSMV 在麥類作物和短柄草中vsiR_miR164 或vsiR_miR171 的表達變化。

5、結(jié)論與討論

研究內(nèi)源miRNA 的功能，首先，要獲得miRNA 序列，這可以通過生物信息學(xué)預(yù)測、高通量測序或直接克隆得到。其次，要研究miRNA 的功能，過表達和沉默是研究內(nèi)源miRNA 功能的重要技術(shù)手段，可以借助于miRNA 高表達載體在植物中瞬時或穩(wěn)定的高表達內(nèi)源miRNA，也可以通過amiRNA 技術(shù)和miRNA target mimic 技術(shù)沉默內(nèi)源miRNA。此外，通過生物信息學(xué)方法預(yù)測內(nèi)源miRNA 的靶標基因，對其靶標基因的功能分析也可以間接證明內(nèi)源miRNA 的功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，在麥類作物和短柄草植物中，BSMV 病毒載體可通過表達內(nèi)源miRNAs 的前體以過表達與miRNA 序列相同的sRNAs（即vsiRNAs）或表達適當(dāng)?shù)膙amiRNAs 以沉默相應(yīng)的內(nèi)源miRNAs?；蛟S，BSMV 病毒載體還可以結(jié)合STTM 技術(shù)，或?qū)崿F(xiàn)對內(nèi)源miRNAs 的沉默?？傮w來看，這使得鑒定麥類作物和模式植物短柄草內(nèi)源miRNAs 的靶標基因成為可能。