龍維虎 王陳蕓 李哲麗 葉尤松 施紅進 李 濤 肖 涵 唐東紅??

（1 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所 云南昆明 650118 2 云南中醫(yī)藥大學(xué) 云南昆明 650200）

近年來，隨著生活水平的提高，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，食物攝入過量，血清高尿酸呈上升趨勢[1]。我國高尿酸血癥人群數(shù)量達1 億多，發(fā)病年齡逐漸縮小。高尿酸血癥人群主要表現(xiàn)為血清尿酸鹽濃度過高，女性血尿酸濃度高于6.0 mg/dL，男性血尿酸濃度高于7.0 mg/dL，臨床診斷為高尿酸血癥[2]。血清尿酸水平的升高會增加痛風(fēng)、高血壓、心臟病、糖尿病的發(fā)病風(fēng)險，控制血清高尿酸水平，已成為治療代謝綜合征相關(guān)疾病的有效手段[3-7]。體內(nèi)尿酸的產(chǎn)生及代謝包括肝臟尿酸產(chǎn)生的調(diào)節(jié)，腎臟、小腸的重吸收及調(diào)節(jié)等復(fù)雜過程[8]，通過尿酸轉(zhuǎn)運蛋白完成腎臟和小腸的尿酸分泌及重吸收，保持著血尿酸的平衡[9]。

葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（glucose transporters，GLUT）是將細胞外葡萄糖轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)的一個跨膜蛋白家族，參與葡萄糖代謝、免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)10 多種參與葡萄糖運輸?shù)牡鞍踪|(zhì)，分布在不同組織，功能也不完全相同，其中GLUT9 由SLC2A9基因編碼，發(fā)揮著將尿酸轉(zhuǎn)運到細胞外，維持機體血清尿酸平衡的作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)，敲除SLC2A9基因的小鼠表現(xiàn)出尿酸濃度偏高，易發(fā)生腎結(jié)石及腎臟纖維炎癥等疾病[11]。遺傳學(xué)研究表明，影響尿酸的排泄原因約90%認為是基因多態(tài)性遺傳缺陷使近端腎小管對尿酸鹽重吸收的轉(zhuǎn)運蛋白GLUT9 功能發(fā)生異常所致[12]，可見GLUT9 對調(diào)節(jié)尿酸鹽水平起著重要影響。

樹鼩（Tupaia belangeri chinensis）屬攀鼩目，樹鼩科，云南是野生樹鼩主要分布區(qū)域之一，其具有生殖和發(fā)育周期短、方便飼養(yǎng)、進化程度高等特征，研究證明樹鼩與靈長類動物具有較近的親緣關(guān)系[13]。在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)等方面更適合用于人類的生物學(xué)和疾病機理研究[14]，目前與人類代謝疾病相關(guān)的機理研究主要有糖代謝、脂代謝、骨質(zhì)疏松癥等[15]。近年來利用樹鼩作為動物模型開展高尿酸致病機理研究也有報道，肌苷作為合成尿酸的原材料，經(jīng)過PNP 酶的水解作用后生成尿酸，Tang 等[16-17]和楊旭娟等[18]利用肌苷成功誘導(dǎo)高尿酸血癥獼猴動物模型，以及利用氧嗪酸鉀成功誘導(dǎo)樹鼩的高尿酸血癥。可見，樹鼩也是高尿酸血癥動物模型研究中一種重要的實驗動物。本研究建立了實時熒光定量檢測樹鼩動物葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)轉(zhuǎn)錄水平變化的方法，旨在為進一步研究高尿酸疾病的發(fā)病機制和藥物治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：普通環(huán)境下（溫度20～25℃，濕度40%～70%）飼養(yǎng)的滇西樹鼩6 只，雌、雄各3 只，體重約120 g，2 周齡左右。由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滇）K2013-0001。使用許可證號為SYXK（滇）K2013-0001。動物實驗由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物研究所動物實驗倫理委員會審批，批準(zhǔn)編號為DWS2017058，實驗程序符合動物實驗倫理委員會的要求，并遵守國際慣例，根據(jù)實驗動物使用的3R 原則給予人文關(guān)懷。

主要試劑：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit（Perfect Real Time）、RT-PCR 酶GoTaq?GreenMaster Mix 2、實時熒光酶SYBR Premix Ex Taq、DL2000 及DL1000 DNA marker（TaKaRa 公司）、RNA 提取液Tripure（Roche 公司）、別嘌醇（純度≥98%，南京都萊生物）、GelRed 染料（Biotium 公司）、肌苷（Sigma 公司）。

主要儀器：高速離心機（美國Sigma 公司）、高通量組織研磨器（寧波新芝公司）、酶標(biāo)儀MQX200R（Bio-tek 公司）、ND-1000 超微量核酸測定儀（美國DanoDrop 公司）、CFX 96TMReal-Time System C1000TMThermal Cycler（美國Bio-rad 公司）。

1.2 實驗方法

1）引物設(shè)計與合成：引物參照人類、獼猴、小鼠目的基因SLC2A9序列設(shè)計引物：人類NM_020041.2和NM_001001290.1，獼猴XM_015137992.1，小鼠NM_001102414.1、NM_001012363.2、NM_001102415.1和 NM_145559.2。內(nèi)參GAPDH參照獼猴NM_001195426.1 的核苷酸序列，利用引物設(shè)計軟件Pimer Express 5.0 分別設(shè)計引物。其中SLC2A9上游引物5′-ACAATGAAGCAGGAGCGACA-3′，下游引物5′-ACTCAGGGTGATGTACGGGA-3′，產(chǎn)物大小210 bp；內(nèi)參GAPDH，上游引物5′-AGCCCCATCACCATCTTCC-3′，下游引物5′-AATGAGCCCCAGCCTTCTC-3′，產(chǎn)物大小121 bp；大連寶生物工程有限公司合成。

2）組織取樣及總RNA 提?。河?.5%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射樹鼩，安樂處死動物，迅速采集新鮮腎臟約100 mg，加入1 mL Tripure，加入適合大小的鋼珠，放入高速組織研磨器中徹底研磨；放入1.5 mL EP 管中靜置5 min，加入氯仿200 μL 充分渦旋，靜置15 min；12 000 r/min 離心25 min 后取450 μL 上清液于EP 管中，加450 μL異丙醇，混勻后靜置10 min 后離心；管內(nèi)壁稍干后加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，離心棄上清液，加入30 μL DEPC 水溶解，水浴10 min。取總RNA 樣品1 μL，測量濃度后，加入DEPC 水稀釋。

3）RNA 完整性檢測：將上述所提取的總RNA樣品各2 μL，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后觀察5S、18S 和28S 條帶，再取1 μL 于ND-1000 超微量核酸測定儀測定RNA 濃度。

4）RNA 逆轉(zhuǎn)錄：按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作，分別加入0.5 μL PrimeScript RT Enzyme Mix、2 μL 5×PrimeScript Buffer、0.5 μL Random 6 mers、0.5 μL Oligo dT Primer、1 μL RNA（1 000 ng/μL）、RNase Free dd H2O 5.5 μL，總體積10 μL。程序設(shè)置為：37℃15 min，85℃5 s，4℃10 min 條件下獲得cDNA。

5）建立SLC2A9及GAPDHmRNA 實時熒光定量PCR 反應(yīng)熔解曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線：以Esidilution梯度稀釋逆轉(zhuǎn)錄合成的樹鼩cDNA 第1 鏈，分別稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4倍濃度，以原始cDNA第1 鏈及稀釋后的cDNA 為模板，各做2 個平行樣進行實時熒光定量檢測。目的基因和內(nèi)參基因反應(yīng)體系如下：1 μL cDNA 模板，各1 μL 的上、下游引物，9.5 μL 去離子水，12.5 μL Taq II 酶；反應(yīng)條件：94℃30 s，94℃5 s、60℃30 s，35 個循環(huán)，獲得Ct值，建立SLC2A9及內(nèi)參GAPDH的相關(guān)熔解曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線、斜率及R2值、擴增效率。

6）PCR 產(chǎn)物測序驗證：SLC2A9及GAPDH的PCR 擴增產(chǎn)物分別通過昆明鉑尚生物公司測序，測序所得到的核苷酸序列通過DNAMAN 軟件與NCBI 所報道的人類的SLC2A9mRNA 的核苷酸片段序列（NM_020041.2）及GAPDHmRNA 的核苷酸片段序列（NM_001289745.3）進行同源性比對。

7）肌苷致樹鼩高尿酸血癥動物模型樹鼩腎臟組織中SLC2A9mRNA 相對表達量變化檢測：選取6 只空腹樹鼩，每組2 只分3 組。第1 組腹腔注射300 mg/kg 肌苷（inosine）和30 mg/kg 別嘌醇（allopurinol，ALLO）、第2 組腹腔注射300 mg/kg肌苷、第3 組0.9%的生理鹽水。注射1 h 后安樂處死實驗動物，取腎臟組織100 mg，加入1 mL Tripure 后提取RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用cDNA 的第1 條鏈作為模板，每個檢測樣品做復(fù)孔。CFX Manager 軟件處理分析結(jié)果，得到對應(yīng)的Ct值，以樣品Ct值，通過軟件分析獲得ΔΔCt值，得到組織中SLC2A9mRNA 表達量變化。

2 結(jié)果

2.1 RNA 純度和完整性 樹鼩總RNA 樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，觀察到3 條帶亮度如圖1所示。說明提取的RNA 沒有發(fā)生降解，經(jīng)ND-1000 超微量核酸測定儀測定結(jié)果顯示A260/A280位于1.8～2.0之間，可用于后續(xù)實驗。

圖1 樹鼩組織總RNA 凝膠電泳

2.2 目的基因SLC2A9和內(nèi)參GAPDHPCR 產(chǎn)物測序及序列比對 將目的基因及內(nèi)參基因PCR擴增產(chǎn)物送至昆明鉑尚生物公司測序后，用DNAMAN軟件分別對與NCBI 報道的人類SLC2A9（NM_020041.2）和GAPDH（NM_001289745.3）核苷酸片段序列的同源性進行比對（圖2、圖3），結(jié)果顯示樹鼩腎臟組織中擴增出的SLC2A9mRNA 的核苷酸片段序列與人類的同源性為81%，GAPDHmRNA 的核苷酸片段序列與人類的同源性為95.1%。進一步說明擴增出的目的片段為樹鼩的GAPDH的核苷酸片段及SLC2A9mRNA 核苷酸片段。

圖2 樹鼩目的片段SLC2A9核苷酸序列與人類核苷酸序列比對圖

圖3 樹鼩GAPDH 的核苷酸序列與人類核苷酸序列比對圖

2.3 樹鼩腎臟組織SLC2A9和GAPDHmRNA實時熒光定量PCR 熔解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線 通過進行實時熒光定量PCR 反應(yīng)，繪制出樹鼩腎臟組織SLC2A9mRNA 和GAPDHmRNA 實時熒光定量PCR 熔解曲線和擴增曲線（圖4），顯示樹鼩SLC2A9mRNA 和GAPDHmRNA 實時熒光定量PCR 反應(yīng)熔解曲線單峰，特異性好。根據(jù)Ct值，CFX Manager 軟件制作出GAPDHmRNA 和SLC2A9mRNA 擴增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5），GAPDHmRNA 擴增效率為125.4%，斜率為-2.833，R2=0.997；SLC2A9mRNA 擴增效率達到107.7%，斜率為-3.151，R2=0.996。

圖4 SLC2A9（a）和GAPDH（b）mRNA 實時熒光定量PCR 反應(yīng)擴增曲線和熔解曲線

圖5 GAPDH（a、b）和SLC2A9（c、d）mRNA 實時熒光定量PCR 反應(yīng)的擴增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 肌苷所致的高尿酸血癥樹鼩SLC2A9mRNA表達水平的變化 樹鼩被安樂死后，從其新鮮的腎臟組織中提取RNA，經(jīng)實時熒光定量PCR 檢測，以GAPDH為內(nèi)參基因，SLC2A9mRNA 相對表達變化如圖6所示。在腎臟組織中，肌苷組相對于對照組的表達顯著上調(diào)，肌苷加別嘌醇組相對于對照組表達顯著下調(diào)，說明所建立的方法能靈敏地檢測樹鼩高尿酸動物模型SLC2A9mRNA 表達水平的變化。

圖6 樹鼩腎臟組織SLC2A9 mRNA 相對表達變化

3 討論

樹鼩作為一種近年來開發(fā)的實驗動物，NCBI未能檢索到樹鼩SLC2A9mRNA 的核苷酸序列。本實驗通過參考NCBI 數(shù)據(jù)庫的人、小鼠、獼猴核苷酸序列，設(shè)計引物，合適的退火溫度，篩選擴增效果較好的引物。序列比對分析了所獲得的內(nèi)參GAPDH片段及SLC2A9片段，發(fā)現(xiàn)與人類的核苷酸片段序列同源性高達80%以上，說明所擴增的基因片段分別為內(nèi)參基因GAPDH核苷酸片段及目的基因SLC2A9核苷酸片段。同時可見SLC2A9及GAPDH實時熒光定量PCR 擴增特異性較好，熔解曲線為單峰，無雜峰。為保證熒光定量技術(shù)分析結(jié)果的可信度，以10 倍為稀釋因子稀釋不同濃度梯度的cDNA，得到目的基因及內(nèi)參基因表達的標(biāo)準(zhǔn)曲線。擴增效率分別為107.7%和125.4%，R2分別為0.996 和0.997，達到熒光定量要求[19]。說明本研究所建立的實時熒光定量PCR方法可應(yīng)用于定量檢測樹鼩葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT9 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。

肌苷，也稱次黃嘌呤核苷，常用于誘導(dǎo)高尿酸動物模型的藥物[20]。本實驗采用腹腔注射300 mg/kg 肌苷構(gòu)建急性高尿酸樹鼩模型，利用建立的實時熒光定量PCR 方法對高尿酸血癥樹鼩進行SLC2A9mRNA 相對表達量檢測，結(jié)果顯示肌苷給藥組相對于其他組別表達量顯著上調(diào)，與實驗預(yù)期相符。本實驗利用實時熒光定量PCR 方法對樹鼩SLC2A9mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的變化實現(xiàn)定量檢測，穩(wěn)定重復(fù)性高、可操作性強等優(yōu)點。雖然樹鼩數(shù)量來源有限，但實驗數(shù)據(jù)和結(jié)果仍具有一定的參考性，建立的檢測樹鼩葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT9 mRNA 相對表達水平的實時熒光定量方法可應(yīng)用于高尿酸血癥的發(fā)病機理、新藥研究等方面的研究。