李天芝，于新友，李 峰

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

輪狀病毒（rotavirus, RV）是呼腸孤病毒科輪狀病毒屬成員[1]，病毒粒子無囊膜，大致呈圓形，具有雙層衣殼，直徑大小約65～75 nm。病毒對外界環(huán)境抵抗力強(qiáng)，可感染豬、牛、羊、兔、禽等多種動物[2]，也能感染人，是一種人獸共患病原體。輪狀病毒分為10個群（RVA、RVB、RVC、RVD、RVE、RVF、RVG、RVH、RVI、RVJ），其中，RVA、RVB、RVC、RVE、RVH是引起豬輪狀病毒?。╬orcine rotavirus disease, PRVD）的重要病原。各品種和日齡豬均可感染，7日齡內(nèi)仔豬受到的危害嚴(yán)重，死亡率高。臨床表現(xiàn)為水樣腹瀉、嘔吐、脫水、厭食、迅速消瘦等，成年豬感染后癥狀輕微，可耐過，當(dāng)混感大腸桿菌、魏氏梭菌等其他病原時癥狀明顯嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。1974年，英國首次報(bào)道了輪狀病毒病，隨后在北美洲、非洲和澳大利亞均有相關(guān)報(bào)道。1981年，我國首次分離到RV，目前豬輪狀病毒病在全國范圍均有發(fā)病和流行。本文對豬輪狀病毒病的病原學(xué)、流行病學(xué)、國內(nèi)豬輪狀病毒病流行現(xiàn)狀、現(xiàn)有商品化疫苗及防控措施等方面進(jìn)行了較全面的闡述，以期為該病的防控工作提供參考。

1 病原學(xué)

RV是冠狀病毒科冠狀病毒屬病毒，無囊膜，大致呈球形。病毒粒子直徑大小約65～75 nm，有雙層衣殼?；蚪M由11個正鏈RNA片段組成，編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白VP1～VP4、VP6、VP7和6個非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp1～Nsp6[3]，其中VP1、VP2和VP3構(gòu)成了病毒內(nèi)衣殼，VP6構(gòu)成了病毒中間衣殼，VP7和VP4構(gòu)成了病毒內(nèi)衣殼，Nsp4對病毒致病性起決定性作用[4]。病毒粒子在氯化銫密度梯度中的浮密度為1.36～1.38 g/cm3。RV血清型眾多，不同血清型之間交叉保護(hù)力差。部分RV具有血凝活性，能凝集人O型、兔、雞等多種動物紅細(xì)胞。RV致病性強(qiáng)，90個病毒粒子可引起不吃母乳的仔豬發(fā)生腹瀉和排毒，1 g病豬排出的糞便含有的感染性病毒粒子為1×1010個。RV對外界環(huán)境抵抗力強(qiáng)，室溫下糞便中病毒7個月后仍有感染性[5]，可穩(wěn)定存在于自然環(huán)境中。自然干燥不能徹底滅活病毒，56 ℃30 min病毒仍能存活。RV對1%甲醛消毒劑有一定耐受性，對鹵素或酚類消毒劑敏感。輪狀病毒體外分離培養(yǎng)時需要添加胰酶，能用于輪狀病毒培養(yǎng)的細(xì)胞有恒河猴腎細(xì)胞、胰島細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì)胞、豬腎細(xì)胞等。

2 流行病學(xué)

RV感染宿主廣泛，包括人、豬、牛、羊、兔、禽等。PRVD在我國流行范圍廣，抗體陽性率最高可達(dá)95.7%，病毒陽性率最高可達(dá)68.4%，且在腹瀉和非腹瀉豬群中均可檢測到[6]。仔豬感染后能否導(dǎo)致臨床發(fā)病還取決于多種因素，如免疫狀況、年齡、感染劑量和毒力，環(huán)境溫度和衛(wèi)生狀況以及其他微生物的相互作用和飼養(yǎng)條件等。病豬和帶毒豬是PRVD的主要傳染源。病毒主要通過病豬糞便排出體外，污染飲水、飼料及圈舍環(huán)境，通過糞口途徑感染其他健康豬。各日齡豬均可感染發(fā)病，哺乳仔豬病情最嚴(yán)重，尤其是7日齡內(nèi)仔豬，死亡率可高達(dá)100%，保育豬混感或繼發(fā)感染其他病原時，死亡率增加。肥育豬感染后死亡率低，呈一過性腹瀉，但飼料轉(zhuǎn)化率降低，影響日增重和料重比[7]。成年豬發(fā)病較輕，但可長期隱性帶毒，康復(fù)豬可持續(xù)排毒1～2個月。病毒能長期穩(wěn)定存在于環(huán)境中，暴發(fā)PRVD的豬場很難徹底根除，存在再次發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。

3 臨床癥狀和病理變化

哺乳仔豬感染后通常24 h內(nèi)可出現(xiàn)臨床癥狀。主要表現(xiàn)為精神萎靡，厭食，不愿走動，嘔吐，水樣腹瀉，糞便呈黃白色、灰色或黑色，呈水樣或糊狀，仔豬迅速脫水，消瘦，眼窩深陷，肛門周圍被糞便污染，最終衰竭死亡。剖檢可見，胃內(nèi)有凝乳塊，小腸后部病變嚴(yán)重，腸壁變薄，呈透明狀，腸黏膜脫落，腸內(nèi)容物為水樣、灰黃色[8]，腸系膜淋巴結(jié)腫大。

4 實(shí)驗(yàn)室診斷方法

目前，用于檢測豬輪狀病毒的方法很多，包括病毒分離培養(yǎng)鑒定、病毒電鏡觀察、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫層析試紙條方法、分子生物學(xué)檢測方法等。

病毒分離為實(shí)驗(yàn)室PRVD確診的金標(biāo)準(zhǔn)，RV初次分離時需要添加胰酶，病毒分離操作繁瑣、時間長，不利于疾病的快速診斷確診。電鏡觀察為將仔豬糞便及腸道內(nèi)容物等病料，磷鎢酸負(fù)染后，置電鏡下觀察，能直觀看到病毒粒子形狀和大小，但電鏡價(jià)格昂貴，觀察時需要經(jīng)驗(yàn)豐富人員，當(dāng)存在多病毒混感時僅靠形態(tài)觀察很難區(qū)分[9]。王振玲等[10]采集仔豬病料用Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)，分離到1株輪狀病毒，連續(xù)盲傳至4代出現(xiàn)細(xì)胞病變，用Marc-145細(xì)胞進(jìn)行病毒噬斑純化，挑取單克隆病毒株擴(kuò)大培養(yǎng)后，將病毒感染Marc-145細(xì)胞7 d后，應(yīng)用Reed-Muench法計(jì)算輪狀病毒TCID50為106.6/0.1 mL，用感染細(xì)胞超薄切片進(jìn)行電鏡觀察，可見典型的晶格狀排列的輪狀病毒粒子。

ELISA是根據(jù)抗原與抗體結(jié)合原理來對PRVD進(jìn)行診斷，可用于血清抗體的檢測或病原檢測，一次檢測樣品量大，靈敏度高，檢測速度快。孟柳等[11]建立了檢測RV的雙抗夾心ELISA方法。結(jié)果表明，該雙抗體夾心ELISA方法的最佳反應(yīng)條件為：豬抗RV IgG包被濃度為4 μg/mL，兔抗RV IgG最佳工作濃度為3.5 μg/mL，樣品反應(yīng)時間為90 min，酶標(biāo)抗體工作濃度為1∶8 000，以O(shè)D450nm≥0.161作為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。該ELISA的重復(fù)性變異系數(shù)小于10%，最低檢測限為1.25 μg/mL，并與豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬大腸桿菌和沙門氏菌等病原無交叉反應(yīng)。免疫層析試紙條方法在臨床應(yīng)用較多，操作簡便，10 min左右出結(jié)果，不需要儀器和設(shè)備。劉兆磊等[12]制備了一種檢測豬RV抗原的膠體金免疫層析試紙條。結(jié)果表明，所制備的試紙條用于檢測豬RV感染的MA104細(xì)胞培養(yǎng)物，在檢測線處出現(xiàn)紅色反應(yīng)帶，未感染病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物在檢測線處未出現(xiàn)反應(yīng)條帶，試紙條檢出病毒培養(yǎng)液（TCID50是10～6.25/0.1 mL）的最低限為1∶32稀釋，不與相關(guān)的腹瀉病毒如豬傳染性胃腸炎病毒、流行性腹瀉病毒發(fā)生反應(yīng)。

分子生物學(xué)檢測方法是豬輪狀病毒實(shí)驗(yàn)室診斷最常用的方法，主要包括常規(guī)RT-PCR方法、熒光RT-PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）方法。常規(guī)RT-PCR方法是以病毒的RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以PCR進(jìn)行核酸擴(kuò)增來檢測病毒的方法，以其簡便、迅速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)在動物疾病診斷上得到了廣泛的應(yīng)用，是早期病毒檢測采用的方法，因具有檢測時間長、敏感性低、容易產(chǎn)生氣溶膠污染等原因逐漸被淘汰。熒光RT-PCR是最常用的豬輪狀病毒確診方法，敏感性高，特異性好，適合臨床疾病快速檢測。陳如敬等[13]根據(jù)GenBank中登錄的豬輪狀病毒VP6基因序列特征，設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，建立了檢測豬RV的TaqMan熒光RT-PCR方法，該方法敏感性高，對病毒的最低檢測限度為192拷貝/μL，特異性強(qiáng)，對豬常見病原檢測均為陰性，重復(fù)性好，擴(kuò)增相關(guān)系數(shù)為0.999，其組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別為0.25%～1.26%和0.31%～1.49%。LAMP方法是一種恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有操作簡便、快速、高效等特點(diǎn)，適合在現(xiàn)場和基層部門應(yīng)用。胡興義等[14]據(jù)豬RV VP7基因保守序列，設(shè)計(jì)特異性引物，建立了豬RV的RT-LAMP檢測方法。結(jié)果顯示，當(dāng)外引物與內(nèi)引物濃度比為200 nmol/L∶2 400 nmol/L（1∶12）、Bst DNA聚合酶濃度為0.64 U/μL、Mg2+濃度為2.5 mmol/L、dNTP濃度為1.0 mmol/L，在恒溫（60 ℃）條件下作用60 min，擴(kuò)增效果出現(xiàn)明顯“梯狀”條帶，與豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬瘟病毒等無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性，最低檢測分子拷貝數(shù)為1.0×102拷貝/μL，具有極高的敏感性。

5 國內(nèi)豬輪狀病毒病流行現(xiàn)狀

胡興義等[15]2013—2015年從貴州省27個規(guī)模豬場采集203份豬糞便樣本，進(jìn)行病原核酸檢測，結(jié)果顯示，豬輪狀病毒的陽性率為7.88%（16/203）。周玲等[16]對2016年1月至2017年4月從廣東地區(qū)規(guī)?；i場采集的273份腹瀉病料樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，豬RV陽性病料64份，總陽性率23.4%，并未檢測到豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）陽性樣品。喬成鵬等[17]利用巢式PCR方法對2015年1月至2016年10月從我國東北三省地區(qū)多個規(guī)?；i場采集的108份仔豬腹瀉病料和15份健康仔豬糞便樣品進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，黑龍江省豬RVA陽性率為47.4%，豬RVB未檢出，豬RVC陽性率為5.3%。遼寧省豬RVA陽性率為51.5%，豬RVB陽性率為3.03%，豬RVC陽性率為6.1%。吉林省豬RVA的陽性率為21.1%，豬RVB陽性率為7.1%，豬RVC陽性率7.1%。2017年1—12月份，哈獸維科市場部檢測實(shí)驗(yàn)室對收到來自全國24個省市325個規(guī)模豬場的病料樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：豬RV陽性率為5.60%（20/357）。何啟蓋等2016年1—7月共檢測來自全國不同省份的133家豬場腹瀉樣品1 195份，結(jié)果顯示，豬RV陽性樣品數(shù)為31份，陽性率為2.6%。2017年中科基因?qū)幽稀⒑?、四川等全國主要養(yǎng)殖地區(qū)送檢的病料樣品進(jìn)行病原檢測，結(jié)果顯示，豬RV的陽性率為8.89%（12/135）。秦世新等[18]利用熒光定量PCR技術(shù)對湘西州部分豬場的420份糞便樣品進(jìn)行豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬輪狀病毒（RV）的檢測。結(jié)果顯示，RV的陽性率最高，為36.9%，PEDV和RV混合感染率為4.8%，不同日齡的豬均可感染。董波等[19]對2014—2017年間來自閩西地區(qū)規(guī)?；i場的173份腹瀉病例進(jìn)行了豬輪狀病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷，結(jié)果表明豬輪狀病毒病主要發(fā)生在冬季（4.05%），其次是在春季（2.89%）；2014—2017年豬RV的陽性率分別為22.22%、30.90%、23.80%、2.70%。

6 防控措施

實(shí)行自繁自養(yǎng)全進(jìn)全出的飼養(yǎng)模式，不從疫區(qū)引進(jìn)種豬，引種豬只要隔離觀察1個月，方可混入大群飼養(yǎng)。加強(qiáng)后備母豬馴化，可以采用疫苗免疫或返飼馴化，激發(fā)母豬產(chǎn)生黏膜免疫抗體，通過乳汁將黏膜免疫抗體傳遞給仔豬，通過乳汁途徑使仔豬獲得免疫力。通過返飼馴化后備母豬，一定要保證病料中無其他病原，并且病毒量要足夠。設(shè)賣豬臺，并遠(yuǎn)離生產(chǎn)區(qū)。飼喂優(yōu)質(zhì)飼料，禁止飼喂霉變飼料，補(bǔ)充足量的維生素及微量元素。

豬舍糞便及時清掃，每天兩次，并運(yùn)送到指定地點(diǎn)，避免豬舍內(nèi)撒漏。每天對豬舍的工具間、飼料間、隔欄等處進(jìn)行打掃與除塵。定期用3%火堿水、生石灰、二氯異氰尿酸鈉或0.5%過氧乙酸等消毒，每周至少兩次，需要注意的是當(dāng)用生石灰進(jìn)行豬舍消毒時，應(yīng)先在豬舍地面灑水，再均勻?yàn)⑸?。也可以采用干粉消毒劑進(jìn)行消毒，不但能殺滅環(huán)境中潛在的病原，還能保持豬舍干燥，并吸附氨氣、硫化氫等有害氣體。禁止無關(guān)人員進(jìn)入豬場，豬場人員進(jìn)場前至少隔離24 h，必須要在更衣、淋浴、消毒之后才能夠進(jìn)入到生產(chǎn)區(qū)。豬場門口設(shè)消毒池，池內(nèi)消毒液配制濃度要合理，并定期更換，車輛進(jìn)入場區(qū)前一定要全方位清洗和消毒，并對消毒效果檢測，合格后才能允許通行。廠區(qū)內(nèi)人員和車流分開，單向通行。飼養(yǎng)人員禁止串舍，初產(chǎn)母豬上產(chǎn)床前需全面沖洗，并消毒，初生仔豬及時吃飽初乳。

豬舍保持適宜的溫度和空氣濕度，寒冷易誘發(fā)仔豬腹瀉，一般母豬最適溫度在25 ℃左右，哺乳仔豬最適溫度30 ℃左右，空氣濕度大病毒存活時間長，干燥的豬舍易于防控豬腹瀉疾病的發(fā)生。做好豬瘟、口蹄疫等其他常規(guī)疫苗的免疫接種工作，并做好免疫記錄。豬場可對母豬接種疫苗預(yù)防輪狀病毒病的發(fā)生，疫苗可選用豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒病、輪狀病毒（G5型）二聯(lián)活疫苗（弱毒華毒株+弱毒CV777株+NX株），待產(chǎn)母豬產(chǎn)前免疫兩針，豬場可酌情選擇跟胎免疫或季節(jié)免疫，要定期監(jiān)測豬群抗體水平，及時查漏補(bǔ)缺，進(jìn)行補(bǔ)免和加免。

豬群發(fā)病時，要隔離病豬，無害化處理病死豬，疫情早期切斷傳播途徑，防止病原擴(kuò)散。全群緊急接種疫苗。母豬和仔豬全群緊急后海穴接種疫苗2頭份，7日齡內(nèi)仔豬直接淘汰，7日齡以上仔豬可提前斷奶，發(fā)病仔豬可對癥治療，口服補(bǔ)液鹽（氯化鈉3.5 g、氯化鉀1.5 g、碳酸氫鈉2.5 g、葡萄糖20 g，加溫水至1 000 mL）。提高豬舍內(nèi)溫度，舍內(nèi)用干粉消毒劑消毒，并在母豬躺臥區(qū)和仔豬休息區(qū)投撒干粉消毒劑。提供充足干凈溫水供豬飲用，飲水中添加抗生素，防止細(xì)菌繼發(fā)感染，飼養(yǎng)管理人員嚴(yán)禁串舍。