馬秋穎，耿懷民，崔鐘池，申松松，王 菲，王海燕，劉大群

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071000）

為抵御各種逆境造成的損害，植物體進(jìn)化出大量能夠識別外界刺激的潛在免疫受體，當(dāng)植物體受到脅迫時，受體通過一系列反應(yīng)將信號傳遞到植物體內(nèi)，從而激發(fā)植物的防御過程［1］。其中類受體蛋白激酶（Receptor-like protein kinase，RLK）是防御反應(yīng)中的一類重要的受體因子［2］，RLKs 可以通過磷酸化和去磷酸化調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，在調(diào)控植物生長發(fā)育和脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用［3］。小麥中類受體蛋白激酶基因TaPK3A能夠提高小麥抗紋枯病的能力［4］；RLK 蛋白TaCRK10 通過與TaH2A互作，激活耐高溫小麥對條銹病的抗性［5］，大豆GsCBRLK的過表達(dá)能夠增強植株對高鹽和ABA 的耐受性［6］。因此，對RLKs 蛋白相關(guān)功能的研究有助于揭示RLKs 在植物抗病防御反應(yīng)中分子機制以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，對分析植物對外界刺激產(chǎn)生的反應(yīng)機制具有很大幫助。

植物病程相關(guān)蛋白5（Pathogenesis-related protein 5，PR5）是一種重要的植物防御蛋白家族，類PR5受體蛋白激酶（PR5 receptor-like protein kinase，PR5Ks）作為RLK 家族的1 個亞族，包含2 個結(jié)構(gòu)域，其中1 個胞外結(jié)構(gòu)域與PR5 相似性高，具有與PR5相似的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)［7］；另1 個是激酶結(jié)構(gòu)域，具有磷酸化活性，其所編碼的蛋白功能與受體激酶一致。PR5Ks 一般是由665 個氨基酸構(gòu)成的多肽序列，該家族與植物的抗病防御反應(yīng)相關(guān)［8］。有研究表明，類受體蛋白激酶GhPR5K可以增強棉花抗黃萎病的能力［9］；擬南芥AtPR5K2通過磷酸化ABI1 和ABI2 調(diào)節(jié)ABA 依賴的干旱脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［10］。

小麥?zhǔn)鞘澜缟现饕募Z食作物之一，對小麥抗病相關(guān)基因的挖掘、抗病機制的研究以及小麥的抗病育種和穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)具有重要意義。目前，RLKs 已被證明在多種抗逆脅迫中發(fā)揮重要作用［11］，作為與PR5 結(jié)構(gòu)相似的受體激酶，PR5Ks 家族的研究相對較少，僅在擬南芥和棉花中被成功分離和鑒定，并初步驗證了其抗干旱和抗病的相關(guān)功能［12］，在小麥中尚未見報道，為此本研究擬利用小麥基因組數(shù)據(jù)庫對小麥PR5Ks 蛋白家族進(jìn)行篩選和鑒定，并從理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行分析，進(jìn)一步探索小麥PR5Ks 蛋白家族的功能特點，為PR5Ks 蛋白家族在小麥抗病防御反應(yīng)中發(fā)揮功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 小麥PR5Ks 蛋白家族的鑒定與理化性質(zhì)分析

結(jié)合在線工具NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）和HMMER（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan） 進(jìn) 行結(jié)構(gòu)域分析，借助小麥基因組數(shù)據(jù)庫（http://plants.ensembl.org）獲得小麥中PR5Ks 序列。利用在線軟件ExPASY-ProtParam（https: // www.expasy.org）對篩選出的小麥PR5Ks 家族進(jìn)行理化性質(zhì)的分析，同時借助在線軟件Cell-PLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/）進(jìn)行該家族的亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.2 小麥PR5Ks 蛋白家族蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線軟件SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）對小麥PR5Ks 蛋白家族進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。利用在線工具SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）對小麥PR5Ks 家族蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)分析。

1.3 小麥PR5Ks 蛋白家族的基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

借助在線工具GSDS（http://gsds. gao-lab. org/index.php）對小麥PR5Ks 家族成員進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。利用蛋白質(zhì)保守基序在線搜索程序MEME（http://meme-suite.org）分析，基序設(shè)置為24 個，其他為默認(rèn)值，對小麥PR5Ks 成員進(jìn)行保守基序分析。

1.4 小麥PR5Ks 家族的啟動子分析

從小麥基因組數(shù)據(jù)庫中獲得17 個小麥PR5Ks基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游2 000 bp 的啟動子序列，提交至在線程序 PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html），預(yù)測順式作用元件，然后使用GSDS 2.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

1.5 抗病相關(guān)PR5Ks基因的初步篩選

為了明確小麥PR5Ks基因的表達(dá)情況，借助expVIP 數(shù)據(jù)庫分析其在赤霉菌（Fusarium graminearum）和條銹菌（Puccinia striiformisf. sp.tritici）脅迫下的表達(dá)水平，最終獲得17 個成員的相關(guān)信息，最后借助TBTools 對PR5Ks基因的表達(dá)模式進(jìn)行可視化和聚類分析。

采用撒粉接種法將小麥葉銹菌THTS 同時接種于小麥感病品種‘Thatcher’和抗病品種‘TcLr19’上，分別取0、12、24、48、72、96、144、168 h 的葉片，以TaPR5K-3、TaPR5K-5、TaPR5K-9和TaPR5K-11序列為靶標(biāo)設(shè)計引物（表1），利用實時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qPCR）技術(shù)，檢測TaPR5K-3、TaPR5K-5、TaPR5K-9和TaPR5K-11葉銹菌誘導(dǎo)時的表達(dá)模式。

表1 qPCR 引物序列Table 1 Primers used for qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥PR5Ks 蛋白家族的鑒定與理化性質(zhì)分析

借助中國春數(shù)據(jù)庫，通過Pfam ID（PF00314）查詢到140 個具有PR5 結(jié)構(gòu)域的基因，獲得序列并提交到NCBI-CDD 在線網(wǎng)站進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)的檢測，最終獲得17 個含有PR5 和激酶結(jié)構(gòu)域的受體蛋白激酶（圖1），將這17 個小麥PR5Ks基因命名為TaPR5K-1～TaPR5K-17（表2）。利用在線網(wǎng)站進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示，17 個小麥PR5Ks基因序列中氨基酸的數(shù)量在415 ～663，相對分子量在73.52（TaPR5K-3） ～44.60 kD（TaPR5K-13）， 等電點介于5.61（TaPR5K-1）～8.4（TaPR5K-13），大多數(shù)屬于酸性蛋白。同時發(fā)現(xiàn)，小麥PR5Ks 蛋白平均疏水性均為負(fù)值，為疏水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，除TaPR5K-13 定位在細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核上，其余小麥PR5Ks 均只在細(xì)胞核中有定位。

表2 小麥PR5Ks 蛋白家族理化性質(zhì)分析Table 2 Physicochemical properties of PR5Ks proteins in wheat

圖1 小麥PR5Ks 蛋白家族的結(jié)構(gòu)域分析Fig. 1 Domain analysis of wheat PR5Ks protein family

2.2 小麥PR5Ks 蛋白家族的結(jié)構(gòu)預(yù)測

對小麥PR5Ks 蛋白家族的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，PR5Ks 蛋白主要由α 螺旋、β 轉(zhuǎn)角、延伸鏈、無規(guī)則卷曲4 種構(gòu)型組成，其中無規(guī)則卷曲所占比重最大，在41.07%～49.16%之間；其次是α 螺旋，占比在25.3% ～34.22%；β 轉(zhuǎn)角占比相對較少，在4.91 ～8.61 之間，主要集中在6%（表3），說明小麥PR5Ks 蛋白家族主要由無規(guī)則卷曲和α 螺旋組成，分布于整條肽鏈中。同時，借助SWISSMODEL 在線工具分析PR5Ks 家族蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，PR5Ks（除TaPR5K-13）蛋白含有大量的α 螺旋和少量的β 折疊，但TaPR5K-13 主要由β 折疊構(gòu)成，表明TaPR5K-13 與其他PR5Ks蛋白相比可能執(zhí)行特殊的功能。雖然這些PR5Ks蛋白的三級結(jié)構(gòu)有一定的相似性，但也存在差異，這些差異可能導(dǎo)致不同的蛋白在功能上有一定的不同（圖2）。

圖2 小麥PR5Ks 蛋白家族三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 2 Prediction of tertiary structure of PR5Ks proteins in wheat

表3 小麥PR5Ks 蛋白家族二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Table 3 Prediction of secondary structure of PR5Ks proteins family in wheat

續(xù)表：

2.3 小麥PR5Ks 蛋白家族基因結(jié)構(gòu)和保守基序的分析

利用在線工具GSDS 對小麥PR5Ks 蛋白家族成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示，17 個PR5Ks中TaPR5K-4、TaPR5K-9、TaPR5K-10、TaPR5K-11、TaPR5K-13、TaPR5K-14、TaPR5K-15、TaPR5K-16均只有一段外顯子，沒有內(nèi)含子區(qū)段；TaPR5K-3有3 個外顯子和2 個內(nèi)含子，剩下8 個PR5Ks包含2個外顯子，被1 個內(nèi)含子分隔開?？傮w來看，小麥PR5Ks有1 ～3 個外顯子，家族結(jié)構(gòu)相對簡單（圖3A）。

通過在線軟件MEME 對小麥PR5Ks 蛋白家族進(jìn)行保守基序分析，17 個小麥PR5Ks 家族共24個motif，均含有motif 4、motif 5、motif 9、motif 10、motif 11，是PR5Ks 蛋白的特征基序。其中TaPRKK-5、TaPRKK-11、TaPRKK-13、TaPRKK-14與其余14 個PR5Ks 相比，所含保守基序較少，差異較大（圖3B）。

圖3 小麥PR5Ks 蛋白家族的結(jié)構(gòu)分析(A)和保守基序分析(B)Fig. 3 Gene structural analysis (A) and conserved motifs (B) of wheat PR5Ks protein family

2.4 小麥PR5Ks基因的啟動子序列分析

為了了解PR5Ks的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，通過PlantCARE在線軟件分析17 個小麥PR5Ks基因上游2 000 bp的啟動子序列包含的順式作用元件。分析結(jié)果顯示，激素響應(yīng)元件有水楊酸響應(yīng)元件TCA-element、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif 和TGACGmotif、ABA 響 應(yīng) 元 件ABRE 等，這 表 明PR5Ks參與激素調(diào)控反應(yīng)。其中TCA-element、CGTCAmotif 和TGACG-motif 為主要的激素響應(yīng)元件，說明PR5Ks可能響應(yīng)SA 或MeJA 信號。此外，小麥PR5Ks基因的啟動子序列中包含的非生物脅迫元件為厭氧誘導(dǎo)元件ARE、低溫響應(yīng)元件LTR、參與干旱誘導(dǎo)的MYB 結(jié)合位點MBS、干旱和鹽響應(yīng)元件MYC 和防御和脅迫響應(yīng)元件TC-rich 元件，這些與非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件的存在說明PR5Ks是受非生物脅迫響應(yīng)的（圖4）?？傮w表明PR5Ks基因在小麥生長發(fā)育中具有一定作用，并且可能參與植物的抗逆、抗病防御反應(yīng)。

圖4 小麥PR5Ks基因啟動子分析Fig. 4 Promoter prediction ofPR5Ksgenes in wheat

2.5 小麥PR5Ks的表達(dá)譜分析

為了初步明確小麥PR5Ks基因的抗病性，借助expVIP 數(shù)據(jù)庫，分析PR5Ks基因在2 種小麥主要病原菌赤霉菌（Fusarium graminearum）和條銹菌（Puccinia striiformisf. sp.tritici）侵染小麥時表達(dá)量的變化并繪制熱圖。分析結(jié)果顯示，在小麥接種赤霉菌后，與對照組相比TaPR5K-2、TaPR5K-3、TaPR5K-5、TaPR5K-6、TaPR5K-7、TaPR5K-9、TaPR5K-11在小麥中均上調(diào)表達(dá)。TaPR5K-3在接種赤霉菌后36 h 和48 h 上調(diào)表達(dá)，約為對照組的11.0 倍和6.4 倍；TaPR5K-2、TaPR5K-5、TaPR5K-6、TaPR5K-9、TaPR5K-11在接種后48 h 表達(dá)量達(dá)到最大，分別約為對照組的4.7，6.7，5.0，5.7 和4.0 倍（見圖5A），表明TaPR5K-2、TaPR5K-3、TaPR5K-5、TaPR5K-6、TaPR5K-7、TaPR5K-9、TaPR5K-11受赤霉菌的誘導(dǎo)。

接種條銹菌后，TaPR5K-8在9 d 和11 d 上調(diào)表達(dá)，約為對照的4.0 和8.6 倍，TaPR5K-9在1 d和11 d 為表達(dá)量的2 個高峰，約為對照的3.4 倍和4.7 倍；TaPR5K-2、TaPR5K-3、TaPR5K-4、TaPR5K-5、TaPR5K-6、TaPR5K-7、TaPR5K-10、TaPR5K-11在接種后1 d 表達(dá)量較高且為最大值（圖5B）。上述基因在接種條銹菌后均有表達(dá)且發(fā)生變化，說明這些基因的表達(dá)量受條銹菌的誘導(dǎo)。

圖5 赤霉菌(A)和條銹菌(B)誘導(dǎo)下小麥PR5Ks基因的表達(dá)模式Fig. 5 Expression pattern of wheatPR5Ksgenes induced byFusarium graminearum(A)andPuccinia striiformisf. sp.tritici(B)

2.6 葉銹菌誘導(dǎo)下小麥PR5Ks的表達(dá)分析

expVIP 數(shù) 據(jù) 庫 分 析 顯 示，TaPR5K-3、TaPR5K-5、TaPR5K-9和TaPR5K-11受 赤 霉 菌 和 條銹菌共同誘導(dǎo)，為明確這4 個基因是否受葉銹菌誘導(dǎo)，以小麥抗病品種‘TcLr19’（非親和組合）和感病品種‘Thatcher’（親和組合）接種小麥葉銹菌THTS，利用qPCR 技術(shù)檢測TaPR5K-3、TaPR5K-5、TaPR5K-9、TaPR5K-11的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，TaPR5K-3在非親和組合中表達(dá)量變化顯著，0 ～72 h 呈上升趨勢，72 h 達(dá)到最大，約為對照組（0 h）的12.0 倍，親和組合中表達(dá)量變化較小；TaPR5K-5在非親和組合中96 ～168 h 表達(dá)量上升顯著，168 h達(dá)到最大，約為對照組的4.8 倍，親和組合中表達(dá)量差異性小，表達(dá)較平穩(wěn)；TaPR5K-11在非親和組合中144 h 為表達(dá)高峰，約為對照組（0 h）的7.2 倍；親和和非親和組合中TaPR5K-9均在72 h 出現(xiàn)表達(dá)高峰，且差異較小，但0 ～168 h 內(nèi)，非親和組合表達(dá)量均高于親和組合（圖6）。表明TaPR5K-3、TaPR5K-5、TaPR5K-9和TaPR5K-11受葉銹菌誘導(dǎo)，且在小麥與葉銹菌互作過程中發(fā)揮正向調(diào)控作用。

圖6TaPR5Ks基因在接種葉銹菌THTS 后的表達(dá)分析Fig. 6 Expression analysis ofTaPR5Ksinoculated with THTS

3 結(jié)論與討論

根據(jù)不同物種的基因組數(shù)據(jù)庫，利用多種生物信息學(xué)技術(shù)篩選、鑒定和分析相關(guān)基因，已經(jīng)成為一種快速、有效篩選目的基因的途徑，例如通過對小麥CIPK基因家族分析，篩選出響應(yīng)不同脅迫的TaCIPK基因［13］；番茄基因組中GRAS 家族成員的分析獲得SLGRAS43基因，并驗證該基因可以增強植物的抗干旱和抗寒冷的能力［14］；Liu 等人通過對菜豆CesA/Csl基因家族全基因組生物信息學(xué)和發(fā)育表達(dá)的分析，初步揭示了菜豆纖維素合酶基因的生化生理功能［15］。本研究借助中國春數(shù)據(jù)庫對小麥PR5Ks 蛋白家族進(jìn)行鑒定，共篩選出17 個PR5Ks成員，在此基礎(chǔ)上對該家族的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析。同源建模是預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的有效工具，在確定蛋白質(zhì)功能時，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息往往比單靠序列數(shù)據(jù)分析更有價值。17 個PR5Ks 三維(3D)模型顯示，TaPR5K-13 與其余蛋白三級結(jié)構(gòu)差異較大，推測TaPR5K-13 可能具有特殊功能，小麥PR5Ks蛋白家族內(nèi)含子/外顯子和保守基序結(jié)構(gòu)相對保守，說明功能上有一定的相似性。

為了探究小麥PR5Ks 蛋白家族功能，本研究對啟動子序列進(jìn)行分析。啟動子是位于基因5’上游的一段DNA 序列，順式作用元件是啟動子上調(diào)控基因表達(dá)所必需的元件，分析基因啟動子上的順式作用元件，可初步預(yù)測該基因可能存在的生物學(xué)功能［16-17］，例如，水稻OsWRKY13基因在水稻抗性防御反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，順式元件PRE4 與OsWRKY13 結(jié)合，調(diào)控OsWRKY13基因表達(dá)［18］。本研究中，PR5Ks啟動子區(qū)域包含多個激素響應(yīng)元件和逆境防御響應(yīng)元件，不同基因元件的種類和數(shù)量有所不同，說明PR5Ks 家族響應(yīng)不同的刺激信號。SA 和MeJA 是調(diào)節(jié)植物脅迫的信號分子，在植物生長發(fā)育和抗病反應(yīng)中發(fā)揮作用［19］，TaPR5K-4、TaPR5K-7、TaPR5K-10、TaPR5K-11、TaPR5K-17同時含有SA 和MeJA 信號響應(yīng)元件，推測這些基因可能是小麥PR5Ks基因參與生物脅迫時的關(guān)鍵基因。同時，PR5Ks啟動子區(qū)域還包括逆境響應(yīng)元件，說明PR5Ks 可能參與小麥的生物或非生物脅迫響應(yīng)與調(diào)控。總體分析表明，PR5Ks啟動子區(qū)域順式作用元件功能多樣，類型豐富，說明PR5Ks 家族可能在小麥的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

基因的表達(dá)模式往往和功能密切相關(guān)，為了進(jìn)一步分析PR5Ks 蛋白家族是否參與抗病防御反應(yīng)，可以通過模擬接種病原菌時各基因表達(dá)量的變化趨勢初步判斷是否具有抗病功能。對51 個大豆Hsp20基因在生物脅迫下的表達(dá)分析，初步揭示了大豆Hsp20基因在抗逆反應(yīng)中的作用［20］；Chen等人通過對不同脅迫下的基因表達(dá)譜分析，篩選到GmPI-PLC7基因并證明該基因在抗干旱和鹽脅迫中的作用，為GmPLC基因響應(yīng)非生物脅迫的功能分析提供了新的思路［21］。在本研究中，通過模擬接種赤霉菌和條銹菌，篩選出4 個PR5K基因，TaPR5K-3、TaPR5K-5、TaPR5K-9、TaPR5K-11在赤霉菌和條銹菌誘導(dǎo)中均上調(diào)表達(dá)，初步認(rèn)為4 個TaPR5K基因可能參與小麥抗病防御反應(yīng)。

綜上所述，小麥PR5Ks 蛋白家族共發(fā)現(xiàn)17 個成員，主要定位細(xì)胞核中，基因結(jié)構(gòu)相對保守，啟動子區(qū)域存在多個激素響應(yīng)元件和逆境響應(yīng)元件，TaPR5K-3、TaPR5K-5、TaPR5K-9、TaPR5K-11受赤霉菌、條銹菌和葉銹菌誘導(dǎo)表達(dá)。后續(xù)可以通過基因沉默等技術(shù)進(jìn)一步驗證4 個基因的功能，為進(jìn)一步研究PR5Ks 在小麥抗病防御反應(yīng)中功能提供參考。