魏雅迪，曹麗萍，劉英姿，劉曉穎，曹宏哲，張 康，邢繼紅，董金皋

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室/河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000；2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 齊齊哈爾分院，黑龍江 齊齊哈爾 161000；3. 河北省承德市園林管理中心，河北 承德 067000）

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）是一種引起植物灰霉病的重要病原真菌，它可以侵染蔬菜、水果等上千種寄主植物［1］?；移咸焰咭殉蔀檠芯恐参锊≡婢哪Ｊ讲≡?，其生長(zhǎng)發(fā)育和致病相關(guān)基因的功能與機(jī)制研究，不僅為深入研究灰葡萄孢生長(zhǎng)發(fā)育和致病力的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，也為其他植物病原真菌的相關(guān)研究提供重要參考［2］。

異三聚體G 蛋白是普遍存在于真核生物中，參與多種重要的生理過程［3］。絲狀真菌G 蛋白于1993 年首次報(bào)道，已明確其在生長(zhǎng)、無(wú)性和有性發(fā)育中是必不可少的［4］；其中，G 蛋白α 亞基參與了營(yíng)養(yǎng)感知、信息素反應(yīng)以及致病等過程的調(diào)控［5］。Gα亞基在稻瘟病菌（Magnaporthe grusea）的生長(zhǎng)、繁殖以及致病過程中都具有重要的作用［6］。灰葡萄孢Gα亞基位于cAMP 信號(hào)通路上游，參與病菌的菌絲生長(zhǎng)、分生孢子發(fā)育、分生孢子萌發(fā)以及致病過程［7］。Gα亞基基因BcBCG1調(diào)控病菌的菌落形態(tài)和侵染能力，BcBCG2、BcBCG3基因的突變體可以對(duì)寄主進(jìn)行侵染，但是與野生型相比侵染速度緩慢［8-9］，且BcBCG3基因的突變體分生孢子的發(fā)育和分生孢子萌發(fā)均具有特異性缺陷［6］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究利用RNAi 技術(shù)獲得了灰葡萄孢BcBCG2和BcBCG3基因的RNAi 沉默突變體，通過對(duì)突變體的表型和致病力進(jìn)行分析，明確了BcBCG2和BcBCG3正調(diào)控病菌的菌絲生長(zhǎng)、分生孢子的產(chǎn)量、致病力和穿透能力［10］。

灰葡萄孢BcPDR1基因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)室前期研究獲得，利用基因敲除和互補(bǔ)回復(fù)技術(shù)明確了BcPDR1基因正調(diào)控病菌的菌絲生長(zhǎng)、分生孢子和菌核的發(fā)育、菌絲侵染結(jié)構(gòu)的形成以及致病力［11-12］。本研究利用qRT-PCR 技術(shù)分析BcPDR1基因突變對(duì)BcBCG2、BcBCG3基因表達(dá)的影響，以及BcBCG2、BcBCG3基因突變對(duì)BcPDR1基因表達(dá)的影響，確定BcPDR1基因與Gα 亞基基因之間的調(diào)控關(guān)系；在BcPDR1基因敲除突變體ΔBcpdr1的背景下，構(gòu)建Gα 亞基基因中過表達(dá)菌株ΔBcpdr1/BcBcBCG2-OE 和ΔBcpdr1/BcBCG3-OE， 通 過 分析過表達(dá)菌株的表型和致病力，明確BcPDR1基因與BcBCG2、BcBCG3基因之間的關(guān)系，從而確定BcPDR1基因與病菌cAMP 信號(hào)通路之間的關(guān)系，為闡明灰葡萄孢BcPDR1基因調(diào)控病菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病力的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

灰葡萄孢野生型菌株BC22、BcPDR1基因的T-DNA 插入突變體BCt89、敲除突變體ΔBcpdr1和 回 復(fù) 菌 株CE［13］，BcBCG2、BcBCG3基 因 的RNAi 菌株，均由河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存及提供。

1.2 qRT-PCR 分析

利用qRT-PCR 技術(shù)，分析灰葡萄孢野生型菌株BC22，BcPDR1基因的缺失突變體BCt89和ΔBcpdr1和互補(bǔ)回復(fù)菌株CE 中的BcBCG2、BcBCG3基因的表達(dá)水平以及BcBCG2、BcBCG3基因的RNAi 沉默突變體中BcPDR1基因的表達(dá)水平。以灰葡萄孢Tubulin基因?yàn)閮?nèi)參基因，用BcBCG2、BcBCG3和BcPDR1基因的特異性引物（見表1），以各菌株的cDNA 為模板，進(jìn)行qRT-PCR 分析。

表1 qRT-PCR 引物設(shè)計(jì)Table 1 Primers for qRT-PCR

1.3 Gα 亞基基因過表達(dá)菌株的構(gòu)建

1.3.1 Gα亞基基因過表達(dá)載體的構(gòu)建 用BcBCG2、

BcBCG3基因的特異性引物和灰葡萄孢野生型BC22菌株的cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增BcBCG2、BcBCG3基因的編碼區(qū)序列，電泳分離、純化后進(jìn)行克隆、測(cè)序。將測(cè)序正確的BcBCG2、BcBCG3基因序列與基因過表達(dá)終載體pEarly gate 103 連接，菌落PCR 和測(cè)序鑒定后，獲得BcBCG2、BcBCG3基因的過表達(dá)載體pEarly gate 103-BcBCG2、pEarly gate 103-BcBCG3。

1.3.2 Gα 亞基基因過表達(dá)轉(zhuǎn)化子的獲得與鑒定 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法［14］，將pEarly gate 103-BcBCG2、pEarly gate 103-BcBCG3分 別 轉(zhuǎn)化BcPDR1基因敲除突變體ΔBcpdr1中，獲得轉(zhuǎn)化子后在含有抗性的培養(yǎng)基中進(jìn)行多次篩選，然后利用PCR 和qRT-PCR 技術(shù)分別從DNA 水平和轉(zhuǎn)錄水平對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定。

1.4 Gα 亞基基因過表達(dá)菌株的表型分析

將灰葡萄孢野生型BC22 和突變體ΔBcpdr1、ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BcBCG3-OE 分 別接種在PDA 培養(yǎng)基上，20 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，對(duì)其菌落形態(tài)、菌核產(chǎn)生等表型進(jìn)行觀察；同時(shí)，收集各菌株的分生孢子，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)各菌株的分生孢子數(shù)量；制備各菌株的菌絲懸浮液，顯微鏡下觀察其菌絲形態(tài)；分別將各菌株的菌盤（Φ=8.0 mm）接種在新的PDA 培養(yǎng)基上，20 ℃黑暗培養(yǎng)，每天定時(shí)測(cè)定各菌株的菌落直徑，進(jìn)而分析菌株的生長(zhǎng)速率［15］

1.5 Gα 亞基基因過表達(dá)菌株的致病力分析

將灰葡萄孢野生型BC22 和突變體ΔBcpdr1、ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BcBCG3-OE 定量（菌盤Φ=8.0 mm）接種到離體的番茄果實(shí)上，檢測(cè)各菌株的致病力，測(cè)量其病斑面積。

2 結(jié)果與分析

2.1BcPDR1基因?qū)α 亞基基因表達(dá)的影響

利用qRT-PCR 技術(shù)，分析BcPDR1基因突變體Gα亞基基因BcBCG2、BcBCG3的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BcPDR1基因缺失突變體BCt89 和ΔBcpdr1中BcBCG2、BcBCG3基因的表達(dá)水平顯著高于野生菌株BC22 和回復(fù)菌株CE（見圖1）。表明BcPDR1基因缺失影響了BcBCG2、BcBCG3基因的表達(dá)，也說明BcPDR1基因負(fù)調(diào)控BcBCG2、BcBCG3基因的表達(dá)。

圖1BcPDR1基因突變體中BcBCG2和BcBCG3基因的表達(dá)分析Fig.1 Expression levels ofBcBCG2andBcBCG3inBcPDR1mutants

2.2 Gα 亞基基因?qū)cPDR1基因表達(dá)的影響

利用qRT-PCR 技術(shù)，分析Gα亞基基因BcBCG2、BcBCG3的突變對(duì)BcPDR1基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BcBCG2、BcBCG3的RNAi 沉默突變體中BcPDR1基因的表達(dá)水平顯著低于野生型菌株BC22（圖2）。表明BcBCG2、BcBCG3基因突變影響了BcPDR1基因的表達(dá)，也說明BcBCG2、BcBCG3基因正調(diào)控BcPDR1基因的表達(dá)。

圖2BcBCG2和BcBCG3基因突變體中BcPDR1基因的表達(dá)分析Fig. 2 Expression levels of theBcPDR1in RNAi mutants ofBcBCG2andBcBCG3genes

2.3BcBCG2、BcBCG3過表達(dá)菌株的構(gòu)建

利用Gateway 技術(shù)，成功構(gòu)建了BcBCG2和BCBCG3基因的過表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將目的基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到突變體ΔBcpdr1中，通過抗性篩選獲得轉(zhuǎn)化子，在對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR 驗(yàn)證后進(jìn)行qRT-PCR 分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BcBCG2、BcBCG3基因的轉(zhuǎn)化子中BcBCG2和BcBCG3基因的表達(dá)水平顯著高于突變體ΔBcpdr1（圖3）。表明了BcBCG2和BCBCG3基因的過表達(dá)菌株ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BCBCG3-OE 構(gòu)建成功。

圖3BcBCG2和BcBCG3過表達(dá)菌株的基因表達(dá)分析Fig.3 Gene expression analysis inBcBCG2andBcBCG3overexpressing strains

2.4BcBCG2、BcBCG3過表達(dá)菌株的表型分析

對(duì)ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BCBCG3-OE 菌株的菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)進(jìn)行觀察（見圖4），發(fā)現(xiàn)過表達(dá)菌株ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BCBCG3-OE 的菌落灰褐色，產(chǎn)生大量菌核，菌絲灰黑色、分隔明顯，與野生型BC22 的表型非常一致，而顯著區(qū)別于BcPDR1基因的敲除突變體ΔBcpdr1。對(duì)過表達(dá)菌株的菌絲生長(zhǎng)速率和分生孢子產(chǎn)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BCBCG3-OE 菌株的生長(zhǎng)速率和分生孢子數(shù)量均與野生型較為接近，其生長(zhǎng)速率與野生型沒有明顯差別，其產(chǎn)孢量略低于野生型；過表達(dá)菌株的生長(zhǎng)速率和分生孢子數(shù)量均顯著區(qū)別于突變體ΔBcpdr1。表明BcBCG2、BcBCG3基因的過表達(dá)使突變體ΔBcpdr1的表型得到了恢復(fù)，也說明BcPDR1基因與BcBCG2、BcBCG3基因之間密切相關(guān)。

圖4BcBCG2和BcBCG3過表達(dá)菌株的表型分析Fig. 4 Phenotypic analysis of over-expression isolates ofBcBCG2andBcBCG3

2.5BcBCG2、BcBCG3過表達(dá)菌株的致病力分析

以灰葡萄孢野生型BC22菌株和BcPDR1基因的敲除突變體ΔBcpdr1為對(duì)照，對(duì)ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BcBCG3-OE 菌 株 的 致 病力進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)接種野生型BC22 和過表達(dá)菌株的部位均能產(chǎn)生明顯的病斑，且接種過表達(dá)菌株的病斑面積與野生型基本一致，而接種突變體ΔBcpdr1的部位并未產(chǎn)生明顯的病斑（圖5）。表明BcBCG2、BCBCG3基因的過表達(dá)均能使突變體ΔBcpdr1的致病力得到了恢復(fù)，進(jìn)一步說明了BcPDR1基因與BcBCG2、BcBCG3基因之間密切相關(guān)。

圖5BcBCG2和BcBCG3過表達(dá)菌株的致病力Fig. 5 Pathogenicity analysis of over-expression isolates ofBcBCG2andBcBCG3

3 結(jié)論與討論

灰葡萄孢cAMP 信號(hào)途徑在病菌的生長(zhǎng)、發(fā)育和致病過程中起著重要作用。異源三聚體G-蛋白Gα 亞基由BcBCG1［7］、BcBCG2［16］、BcBCG3［17］基因編碼，位于灰葡萄孢cAMP 信號(hào)途徑上游，參與調(diào)控病菌的形態(tài)建成、分生孢子萌發(fā)和侵入生長(zhǎng)［18］。其中，BcBCG1基因的缺失突變體ΔBcBCG1不能產(chǎn)生2 次擴(kuò)展病斑，外源cAMP 的添加可以使ΔBcBCG1突變體的菌落形態(tài)恢復(fù)到野生型；BcBCG2、BcBCG3基因的缺失突變體ΔBcBCG2、ΔBcBCG3可以侵染寄主并能繼續(xù)擴(kuò)展，但是擴(kuò)展速度較野生型緩慢［8-9］。ΔBcBCG3可以使分生孢子萌發(fā)受損并引起延遲發(fā)病。實(shí)驗(yàn)前期研究明確了灰葡萄孢BcPDR1參與病菌的生長(zhǎng)、發(fā)育和致病力的調(diào)控［18］，但是灰葡萄孢BcPDR1與cAMP信號(hào)途徑之間的關(guān)系并未明確［20］。因此，本研究首先利用qRT-PCR 技術(shù)，分析了BcPDR1突變體中BcBCG2、BcBCG3基因表達(dá)水平和BcBCG2和BcBCG3突變體中BcPDR1基因表達(dá)水平，結(jié)果確定了BcPDR1基因負(fù)調(diào)控BcBCG2、BcBCG3基因的表達(dá)，BcBCG2、BcBCG3基因正調(diào)控BcPDR1的表達(dá)，表明了BcPDR1基因與病菌的cAMP 信號(hào)途徑密切相關(guān)。為進(jìn)一步明確BcPDR1基因與BcBCG2和BcBCG3基因之間的關(guān)系，試驗(yàn)成功構(gòu)建了BcBCG2和BCBCG3基因的過表達(dá)菌株ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BcBCG3-OE，然后對(duì)過表達(dá)菌株進(jìn)行表型和致病力分析，確定了BcBCG2和BcBCG3基因的過表達(dá)能夠使BcPDR1基因的敲除突變體ΔBcpdr1的表型和致病力得到恢復(fù)，表明了BcPDR1基因與BcBCG2和BcBCG3基因之間密切相關(guān)，同時(shí)說明了BcPDR1基因與病菌cAMP 信號(hào)途徑之間具有相關(guān)性。但是BcPDR1基因與病菌cAMP 信號(hào)途徑之間的調(diào)控關(guān)系及機(jī)制尚需深入研究，為闡明灰葡萄孢生長(zhǎng)發(fā)育和致病力調(diào)控的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。