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        膠體金免疫層析法檢測(cè)帶魚中氯霉素殘留的前處理方法研究

        2022-11-21 09:25:00閻安婷
        現(xiàn)代食品 2022年20期
        關(guān)鍵詞:氯霉素膠體金正己烷

        ◎ 李 倩,陳 煜,閻安婷

        (山西省檢驗(yàn)檢測(cè)中心藥品檢驗(yàn)技術(shù)研究所,山西 太原 030001)

        帶魚,自古以來就是我國重要的海洋作物之一,在《本草從新》《中華本草》等著作中均有記載。帶魚蛋白含量高,味道鮮美,具有補(bǔ)中益氣、溫胃養(yǎng)肝、補(bǔ)氣血的作用[1]。

        氯霉素為廣譜抗生素,價(jià)格低,療效顯著,多用于動(dòng)物的抗菌治療預(yù)防。氯霉素理化性質(zhì)穩(wěn)定,不容易分解,會(huì)在人體中蓄積,從而引發(fā)血液系統(tǒng)疾病及抗藥性。我國已明確規(guī)定禁止氯霉素在食品動(dòng)物中使用[2]。氯霉素殘留現(xiàn)有檢測(cè)方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、酶聯(lián)免疫法等[3-4],但這些方法前處理復(fù)雜,需要大型檢測(cè)設(shè)備。膠體金免疫層析法操作簡便快速,又具有很好的特異性,無需昂貴的檢測(cè)儀器[5-7]。本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化前處理方法,建立以膠體金免疫層析技術(shù)為基礎(chǔ)的帶魚中氯霉素殘留快速檢測(cè)方法,該方法的建立為其他動(dòng)物藥物殘留的快速檢測(cè)提供有利的技術(shù)支持,對(duì)于今后開展基層食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)工作也具有非常重要的意義。

        1 材料與方法

        1.1 材料與設(shè)備

        帶魚購自太原美特好超市;固相萃取小柱(Cleanert Silica,200 mg/6 mL,LOT:0170198);氯 霉 素 快速檢測(cè)卡(蘇州快捷康生物技術(shù)有限公司,批號(hào):kjk20171125c)。氯霉素,購于Dr. Ehrenstorfer,CAS登錄號(hào)為56-75-7;乙酸乙酯、水、正己烷、丙酮、乙腈、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)及氯化鈉均為分析純。

        Eppendorf移液器、中佳HC-3018高速離心機(jī)、IKA V2S025渦旋混合器及梅特勒-托利多ML204T電子天平。

        1.2 方法

        1.2.1 對(duì)照品溶液的制備

        稱取氯霉素用乙腈稀釋至刻度,搖勻,制成濃度為0.01 μg·mL-1的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液。臨用新配。

        1.2.2 前處理方法研究

        取粉碎均勻的帶魚樣品6 g于50 mL具塞離心管中,分別采用以下4種方法進(jìn)行樣品前處理。

        方法一:加入8 mL乙酸乙酯,渦旋提取5 min,以8 000 r·min-1離心5 min,轉(zhuǎn)移全部乙酸乙酯層 40 ℃氮?dú)獯蹈桑糜?5 mL具塞離心管中,精密加入600 μL復(fù)溶液,渦旋混合1 min,作為待測(cè)液。

        方法二:依次加入4 mL水和8 mL乙酸乙酯,提取同方法一。精密加入600 μL復(fù)溶液和600 μL正己烷,渦旋混合1 min,取下層溶液作為待測(cè)液。

        方法三:依次加入15 mL乙腈勻漿提取,加入 10 mL乙腈飽和的正己烷去脂,離心分層,取乙腈層用氮?dú)獯蹈?,加? mL丙酮-正己烷(1∶9)溶解殘?jiān)齼艋_^LC-Si硅膠小柱,用5 mL丙酮-正己烷(6∶4)洗脫,收集洗脫液用氮?dú)獯蹈桑瑥?fù)溶為待測(cè)液。

        方法四:依次加入4 mL水和8 mL乙酸乙酯,渦旋提取5 min,以4 000 r·min-1離心5 min。轉(zhuǎn)移乙酸乙酯層于50 mL具塞離心管中,加入正己烷25 mL,氯化鈉1 g渦旋混勻,4 000 r·min-1離心1 min,上清液待凈化。凈化同方法三,復(fù)溶為待測(cè)液。

        1.2.3 復(fù)溶液的確定

        通過查閱資料并結(jié)合試劑盒復(fù)溶液的pH值范圍選擇最常用的4種磷酸鹽緩沖液。

        稱取0.12 g磷酸二氫鈉置于100 mL容量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,制成溶液A;稱取7.16 g磷酸氫二鈉置于100 mL容量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,制成溶液B。①取溶液A 3.3 mL、溶液B 6.7 mL、 氯化鈉0.85 g,用水溶解并稀釋至100 mL,得磷酸鹽緩沖液1(pH 7.1)。②取溶液A 2.8 mL、溶液 B 7.2 mL、氯化鈉0.85 g,用水溶解并稀釋至100 mL,得磷酸鹽緩沖液2(pH 7.2)。③取溶液A 2.3 mL、溶液B 7.7 mL、氯化鈉0.85 g,用水溶解并稀釋至100 mL,得磷酸鹽緩沖液3(pH 7.3)。④取溶液A 1.9 mL、溶液B 8.1 mL、氯化鈉0.85 g,用水溶解并稀釋至100 mL,得磷酸鹽緩沖液4(pH 7.4)。

        1.2.4 測(cè)定步驟

        吸取150 μL樣品待測(cè)液滴加到檢測(cè)卡上的加樣孔中,室溫溫育5 min,通過比較控制線、檢測(cè)線的顏色深淺對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。

        1.2.5 測(cè)定條件研究

        本方法的結(jié)果測(cè)定以競(jìng)爭(zhēng)性免疫層析為基礎(chǔ),具有特異、靈敏、快速以及操作簡便等優(yōu)點(diǎn),但其對(duì)反應(yīng)條件及環(huán)境往往具有嚴(yán)格的要求,本方法除了對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,還對(duì)測(cè)定時(shí)間和溫育溫度進(jìn)行研究。測(cè)定時(shí)間分別考察了復(fù)溶后0 min、5 min、10 min、20 min、30 min和60 min測(cè)定效果,溫育溫度對(duì)比了18 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃下的反應(yīng)效果。

        1.2.6 交叉反應(yīng)

        分別取甲砜霉素、氟甲砜霉素,制成水平為 10 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照本方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),考察試劑盒與上述化合物的交叉反應(yīng)。

        1.2.7 與參比方法一致性分析

        稱取空白樣品帶魚為基質(zhì),分別添加3個(gè)濃度水平0 μg·kg-1、0.1 μg·kg-1、0.2 μg·kg-1的盲樣各40份,其中20份按自擬方法的前處理和分析步驟進(jìn)行測(cè)定,另外20份參考《動(dòng)物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測(cè)定》(GB/T 22338—2008)測(cè)定,對(duì)比兩種方法測(cè)定結(jié)果的一致性。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 前處理方法及復(fù)溶液確定

        2.1.1 對(duì)前處理方法進(jìn)行考察

        對(duì)比4種前處理方法發(fā)現(xiàn),方法一樣品加乙酸乙酯后,樣品凝結(jié)成塊,提取過程中不能均勻分散,提取不完全,待測(cè)溶液渾濁不清,無法點(diǎn)樣;方法二加入水后樣品結(jié)塊問題解決,但加入的正己烷量太少,無法完全去脂,待測(cè)溶液依舊渾濁不清;方法三雖然待測(cè)溶液可以達(dá)到滿意的結(jié)果,也消除了脂肪對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾,但乙腈氮吹耗時(shí)過長,無法滿足快檢要求,需進(jìn)一步優(yōu)化,縮短檢測(cè)時(shí)間;方法四試驗(yàn)樣品中添加25 mL正己烷后,待測(cè)溶液清晰,點(diǎn)樣結(jié)果滿意,同時(shí)乙酸乙酯氮吹時(shí)間縮短,單樣時(shí)間控制在 60 min之內(nèi)。因此,采取方法四為本試驗(yàn)最終方法。

        2.1.2 對(duì)復(fù)溶液進(jìn)行考察

        如圖1所示,磷酸鹽緩沖液2(pH 7.2)廠家試劑盒能達(dá)到較好的點(diǎn)板效果。

        圖1 測(cè)試結(jié)果圖

        2.2 測(cè)定條件研究結(jié)果

        結(jié)果表明,在1.2.5各不同時(shí)間段下,待測(cè)液點(diǎn)板后T線顏色沒有明顯差異,時(shí)間的延長對(duì)本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果沒有影響,但是為了避免不確定因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響,建議復(fù)溶后立即測(cè)定。在1.2.5各溫度下,待測(cè)液點(diǎn)板后無明顯差異,溫度對(duì)本試驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果幾乎沒有影響,但是為了避免極端監(jiān)測(cè)環(huán)境對(duì)于檢測(cè)相關(guān)各個(gè)環(huán)節(jié)的影響,建議日常檢驗(yàn)中在室內(nèi)或相對(duì)溫和的檢驗(yàn)環(huán)境中進(jìn)行,故本方法中孵育溫度建議為室溫。

        2.3 交叉反應(yīng)結(jié)果

        交叉反應(yīng)顯示,甲砜霉素、氟甲砜霉素與試劑盒點(diǎn)板后結(jié)果均顯示陰性,表明均無交叉反應(yīng)。

        2.4 與國標(biāo)方法對(duì)比結(jié)果

        表1、表2的檢測(cè)結(jié)果表明,膠體金方法中0 μg·kg-1均未檢出為陰性,0.1 μg·kg-1、0.2 μg·kg-1均可以檢出為陽性。液相色譜-質(zhì)譜法中0 μg·kg-1檢出濃度為 0 μg·kg-1視為陰性,0.1 μg·kg-1、0.2 μg·kg-1均可以檢出符合回收率要求(80%~110%)的濃度視為陽性,因此膠體金試劑盒方法的結(jié)果均與參比方法一致,符合方法一致性要求。

        表1 膠體金免疫層析法檢測(cè)結(jié)果表

        表2 液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)結(jié)果表

        3 結(jié)論

        通過優(yōu)化前處理方法、確定復(fù)溶液等操作建立的膠體金免疫層析技術(shù)相比于傳統(tǒng)氣相色譜、液相色譜、酶聯(lián)免疫方法,具有操作簡單快速、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短、無需大型儀器成本低的特點(diǎn),非常適合作為初篩手段用于基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

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