◎ 李 倩,陳 煜,閻安婷
(山西省檢驗檢測中心藥品檢驗技術(shù)研究所,山西 太原 030001)
帶魚,自古以來就是我國重要的海洋作物之一,在《本草從新》《中華本草》等著作中均有記載。帶魚蛋白含量高,味道鮮美,具有補中益氣、溫胃養(yǎng)肝、補氣血的作用[1]。
氯霉素為廣譜抗生素,價格低,療效顯著,多用于動物的抗菌治療預(yù)防。氯霉素理化性質(zhì)穩(wěn)定,不容易分解,會在人體中蓄積,從而引發(fā)血液系統(tǒng)疾病及抗藥性。我國已明確規(guī)定禁止氯霉素在食品動物中使用[2]。氯霉素殘留現(xiàn)有檢測方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、酶聯(lián)免疫法等[3-4],但這些方法前處理復(fù)雜,需要大型檢測設(shè)備。膠體金免疫層析法操作簡便快速,又具有很好的特異性,無需昂貴的檢測儀器[5-7]。本實驗通過優(yōu)化前處理方法,建立以膠體金免疫層析技術(shù)為基礎(chǔ)的帶魚中氯霉素殘留快速檢測方法,該方法的建立為其他動物藥物殘留的快速檢測提供有利的技術(shù)支持,對于今后開展基層食品藥品檢驗檢測工作也具有非常重要的意義。
帶魚購自太原美特好超市;固相萃取小柱(Cleanert Silica,200 mg/6 mL,LOT:0170198);氯 霉 素 快速檢測卡(蘇州快捷康生物技術(shù)有限公司,批號:kjk20171125c)。氯霉素,購于Dr. Ehrenstorfer,CAS登錄號為56-75-7;乙酸乙酯、水、正己烷、丙酮、乙腈、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)及氯化鈉均為分析純。
Eppendorf移液器、中佳HC-3018高速離心機、IKA V2S025渦旋混合器及梅特勒-托利多ML204T電子天平。
1.2.1 對照品溶液的制備
稱取氯霉素用乙腈稀釋至刻度,搖勻,制成濃度為0.01 μg·mL-1的氯霉素標準工作液。臨用新配。
1.2.2 前處理方法研究
取粉碎均勻的帶魚樣品6 g于50 mL具塞離心管中,分別采用以下4種方法進行樣品前處理。
方法一:加入8 mL乙酸乙酯,渦旋提取5 min,以8 000 r·min-1離心5 min,轉(zhuǎn)移全部乙酸乙酯層 40 ℃氮氣吹干,置于15 mL具塞離心管中,精密加入600 μL復(fù)溶液,渦旋混合1 min,作為待測液。
方法二:依次加入4 mL水和8 mL乙酸乙酯,提取同方法一。精密加入600 μL復(fù)溶液和600 μL正己烷,渦旋混合1 min,取下層溶液作為待測液。
方法三:依次加入15 mL乙腈勻漿提取,加入 10 mL乙腈飽和的正己烷去脂,離心分層,取乙腈層用氮氣吹干,加入5 mL丙酮-正己烷(1∶9)溶解殘渣待凈化。過LC-Si硅膠小柱,用5 mL丙酮-正己烷(6∶4)洗脫,收集洗脫液用氮氣吹干,復(fù)溶為待測液。
方法四:依次加入4 mL水和8 mL乙酸乙酯,渦旋提取5 min,以4 000 r·min-1離心5 min。轉(zhuǎn)移乙酸乙酯層于50 mL具塞離心管中,加入正己烷25 mL,氯化鈉1 g渦旋混勻,4 000 r·min-1離心1 min,上清液待凈化。凈化同方法三,復(fù)溶為待測液。
1.2.3 復(fù)溶液的確定
通過查閱資料并結(jié)合試劑盒復(fù)溶液的pH值范圍選擇最常用的4種磷酸鹽緩沖液。
稱取0.12 g磷酸二氫鈉置于100 mL容量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,制成溶液A;稱取7.16 g磷酸氫二鈉置于100 mL容量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,制成溶液B。①取溶液A 3.3 mL、溶液B 6.7 mL、 氯化鈉0.85 g,用水溶解并稀釋至100 mL,得磷酸鹽緩沖液1(pH 7.1)。②取溶液A 2.8 mL、溶液 B 7.2 mL、氯化鈉0.85 g,用水溶解并稀釋至100 mL,得磷酸鹽緩沖液2(pH 7.2)。③取溶液A 2.3 mL、溶液B 7.7 mL、氯化鈉0.85 g,用水溶解并稀釋至100 mL,得磷酸鹽緩沖液3(pH 7.3)。④取溶液A 1.9 mL、溶液B 8.1 mL、氯化鈉0.85 g,用水溶解并稀釋至100 mL,得磷酸鹽緩沖液4(pH 7.4)。
1.2.4 測定步驟
吸取150 μL樣品待測液滴加到檢測卡上的加樣孔中,室溫溫育5 min,通過比較控制線、檢測線的顏色深淺對結(jié)果進行判定。
1.2.5 測定條件研究
本方法的結(jié)果測定以競爭性免疫層析為基礎(chǔ),具有特異、靈敏、快速以及操作簡便等優(yōu)點,但其對反應(yīng)條件及環(huán)境往往具有嚴格的要求,本方法除了對反應(yīng)體系進行優(yōu)化,還對測定時間和溫育溫度進行研究。測定時間分別考察了復(fù)溶后0 min、5 min、10 min、20 min、30 min和60 min測定效果,溫育溫度對比了18 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃下的反應(yīng)效果。
1.2.6 交叉反應(yīng)
分別取甲砜霉素、氟甲砜霉素,制成水平為 10 ng·mL-1的標準溶液,按照本方法進行實驗,考察試劑盒與上述化合物的交叉反應(yīng)。
1.2.7 與參比方法一致性分析
稱取空白樣品帶魚為基質(zhì),分別添加3個濃度水平0 μg·kg-1、0.1 μg·kg-1、0.2 μg·kg-1的盲樣各40份,其中20份按自擬方法的前處理和分析步驟進行測定,另外20份參考《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》(GB/T 22338—2008)測定,對比兩種方法測定結(jié)果的一致性。
2.1.1 對前處理方法進行考察
對比4種前處理方法發(fā)現(xiàn),方法一樣品加乙酸乙酯后,樣品凝結(jié)成塊,提取過程中不能均勻分散,提取不完全,待測溶液渾濁不清,無法點樣;方法二加入水后樣品結(jié)塊問題解決,但加入的正己烷量太少,無法完全去脂,待測溶液依舊渾濁不清;方法三雖然待測溶液可以達到滿意的結(jié)果,也消除了脂肪對檢測結(jié)果的干擾,但乙腈氮吹耗時過長,無法滿足快檢要求,需進一步優(yōu)化,縮短檢測時間;方法四試驗樣品中添加25 mL正己烷后,待測溶液清晰,點樣結(jié)果滿意,同時乙酸乙酯氮吹時間縮短,單樣時間控制在 60 min之內(nèi)。因此,采取方法四為本試驗最終方法。
2.1.2 對復(fù)溶液進行考察
如圖1所示,磷酸鹽緩沖液2(pH 7.2)廠家試劑盒能達到較好的點板效果。
圖1 測試結(jié)果圖
結(jié)果表明,在1.2.5各不同時間段下,待測液點板后T線顏色沒有明顯差異,時間的延長對本實驗的測定結(jié)果沒有影響,但是為了避免不確定因素對實驗的影響,建議復(fù)溶后立即測定。在1.2.5各溫度下,待測液點板后無明顯差異,溫度對本試驗的測定結(jié)果幾乎沒有影響,但是為了避免極端監(jiān)測環(huán)境對于檢測相關(guān)各個環(huán)節(jié)的影響,建議日常檢驗中在室內(nèi)或相對溫和的檢驗環(huán)境中進行,故本方法中孵育溫度建議為室溫。
交叉反應(yīng)顯示,甲砜霉素、氟甲砜霉素與試劑盒點板后結(jié)果均顯示陰性,表明均無交叉反應(yīng)。
表1、表2的檢測結(jié)果表明,膠體金方法中0 μg·kg-1均未檢出為陰性,0.1 μg·kg-1、0.2 μg·kg-1均可以檢出為陽性。液相色譜-質(zhì)譜法中0 μg·kg-1檢出濃度為 0 μg·kg-1視為陰性,0.1 μg·kg-1、0.2 μg·kg-1均可以檢出符合回收率要求(80%~110%)的濃度視為陽性,因此膠體金試劑盒方法的結(jié)果均與參比方法一致,符合方法一致性要求。
表1 膠體金免疫層析法檢測結(jié)果表
表2 液相色譜-質(zhì)譜法檢測結(jié)果表
通過優(yōu)化前處理方法、確定復(fù)溶液等操作建立的膠體金免疫層析技術(shù)相比于傳統(tǒng)氣相色譜、液相色譜、酶聯(lián)免疫方法,具有操作簡單快速、特異性強、耗時短、無需大型儀器成本低的特點,非常適合作為初篩手段用于基層現(xiàn)場檢測。