臧亮朋，郭佳，鎖嘉偉，王祎萌(寧夏泰益欣生物科技股份有限公司，寧夏 銀川 750205)

0 引言

替米考星(Tilmicosin)是英國Elanco公司于20世紀(jì)末研制成功的一種供畜禽類動(dòng)物使用的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其分子式為C46H80N2O13，分子量為869.15[1]。主要以酒石酸泰樂菌素為原料進(jìn)行半合成?？咕钚约芭R床應(yīng)用效果與泰樂菌素相比更優(yōu)。替米考星的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 替米考星結(jié)構(gòu)式

替米考星的合成途徑為：酒石酸泰樂菌素水解生成中間產(chǎn)物去碳霉糖泰樂菌素，去碳霉糖泰樂菌素與3,5-二甲基哌啶反應(yīng)經(jīng)甲酸還原生成替米考星[2]。化學(xué)反應(yīng)式如圖2所示。

圖2 替米考星合成過程

在畜禽養(yǎng)殖過程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一種較為常見的疾病即呼吸道疾病，在規(guī)模化養(yǎng)殖過程此類疾病帶來的風(fēng)險(xiǎn)更高，因此，有效控制呼吸道類疾病是目前社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)，已有諸多報(bào)道顯示，呼吸道類疾病的病原菌通常為多種革蘭氏陽性菌及部分陰性菌如巴氏桿菌、放線桿菌、禽大腸桿菌及支原體等，在實(shí)際病例中常常是細(xì)菌與支原體混合感染[3]。經(jīng)抗菌活性驗(yàn)證替米考星抗菌效果優(yōu)于氟苯尼考、泰樂菌素抗生素類藥物等，其對(duì)大部分的革蘭氏菌、螺旋體、霉形體等均有較強(qiáng)的抑制作用，尤其對(duì)多種螺旋體和支原體有較強(qiáng)的抑制作用[4]。在我國替米考星有關(guān)物質(zhì)的研究較少，尤其對(duì)于單個(gè)雜質(zhì)的考究關(guān)注更少，文獻(xiàn)多為綜述替米考星的合成研究進(jìn)展或進(jìn)行合成的工藝條件優(yōu)化。孫永學(xué)等[5]介紹了替米考星在臨床上的應(yīng)用情況。劉德金等[6]通過改變流動(dòng)相相關(guān)物質(zhì)的比例優(yōu)化了替米考星的HPLC檢測方法；呂淑榮[7]參照國外相關(guān)專利合成了替米考星，對(duì)合成產(chǎn)品進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證，研究了幾個(gè)關(guān)鍵工藝參數(shù)對(duì)收率的影響，對(duì)合成的替米考星進(jìn)行了質(zhì)量研究，但并未系統(tǒng)地研究其最佳的工藝條件。

在我國，目前市售的替米考星及其同類產(chǎn)品的檢測根據(jù)《中國獸藥典》規(guī)定，將HPLC法作為替米考星檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法，美國獸藥典也收錄了替米考星及其同類產(chǎn)品的HPLC測定方法，只是在流動(dòng)相配制和樣品制備方面存在差異。采用美國獸藥典(USP)有關(guān)物質(zhì)檢測雜質(zhì)H無法較穩(wěn)定控制在合格質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)，不能滿足客戶要求，嚴(yán)重影響該標(biāo)準(zhǔn)要求的產(chǎn)品銷售，為全球的眾多企業(yè)生產(chǎn)帶來較大困難。本文主要研究淋洗工藝對(duì)替米考星雜質(zhì)H的影響，篩選淋洗工藝中最佳工藝參數(shù)，以期提高替米考星質(zhì)量，降低雜質(zhì)H的含量，為替米考星低雜質(zhì)H成品的生產(chǎn)提供理論支撐。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

YP4002電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)、恒溫磁力水浴鍋、電磁攪拌器、島津液相檢測儀、watersC18色譜柱、酸度計(jì)。

1.2 試劑

酒石酸泰樂菌素精制液(寧夏泰益欣生物科技股份有限公司)、甲酸、3,5-二甲基哌啶、乙酸丁酯、酒石酸溶液、NaOH溶液、HCl溶液。

2 材料與方法

2.1 原料來源

本試驗(yàn)原料酒石酸泰樂菌素精制液由寧夏泰益欣生物科技股份有限公司提供，以下實(shí)驗(yàn)過程中，單份精制液試驗(yàn)樣品體積均為200 mL。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 NaOH(10%)溶液配制

準(zhǔn)確稱取10 g固體NaOH置于燒杯中，加入90 g的純化水，玻璃棒攪拌使其溶解澄清后封口膜封口備用。

2.2.2 HCl(5%)溶液配制

準(zhǔn)確稱取430.56 g純化水置于燒杯中，稱量69.44 g HCl緩慢加入燒杯中，不斷用玻璃棒攪拌使其完全溶解后封口膜封口備用。

2.2.3 酒石酸(5%)溶液配制

準(zhǔn)確稱取0.5 g酒石酸銻鉀置于燒杯中，加入少量純化水溶解，再加入到100 mL容量瓶定容。

2.2.4 檢測方法(USP)

用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，以水-磷酸二丁胺溶液(取二正丁胺16.8 mL，加磷酸溶液70 mL，邊加邊攪拌，冷卻后，用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5±0.1，加水至100 mL(975∶25)為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為280 nm，流速為1.1 mL/min。

3 結(jié)果與分析

3.1 泰樂萃取液酸洗及水洗對(duì)合成替米考星雜質(zhì)H的影響

泰樂菌素系列產(chǎn)品眾多，如泰萬菌素、酒石酸泰樂菌素、鹽酸泰樂菌素、替米考星等，這些都屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的衍生產(chǎn)品，其中替米考星效果明顯優(yōu)于泰樂系列其他產(chǎn)品。替米考星有關(guān)物質(zhì)檢測單個(gè)雜質(zhì)較多，而單雜高低不僅影響產(chǎn)品質(zhì)量也對(duì)產(chǎn)品銷售影響較大。在替米考星所有單雜中，雜質(zhì)H波動(dòng)頻繁，因此，如何控制或降低替米考星雜質(zhì)H在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)變得尤為重要。

本文主要以酸洗(5%酒石酸溶液)和水洗(純化水)兩種方式淋洗泰樂菌素萃取液，以未經(jīng)淋洗的萃取液為對(duì)照，泰樂萃取液體積均保證在200 mL，驗(yàn)證其對(duì)替米考星雜質(zhì)H的影響。具體結(jié)果如圖3所示。

將制備完成的泰樂菌素萃取液分別進(jìn)行酸洗、水洗和不做任何處理進(jìn)行對(duì)照。由圖3可知，采用酸洗和水洗，均對(duì)替米考星雜質(zhì)H有一定影響，經(jīng)酸洗后，替米考星雜質(zhì)H得以有效降低，水洗組及對(duì)照組替米考星樣品檢測雜質(zhì)H不合格(標(biāo)準(zhǔn)≤1.0%)；而酸洗后替米考星雜質(zhì)H含量低于1.0%，因此，可確定對(duì)酒石酸泰樂菌素精制液制備完成的萃取液酸洗可有效降低替米考星雜質(zhì)H，排除水洗，確定優(yōu)化方向?yàn)榫剖崴嵯催M(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。

3.2 泰樂萃取液酸洗pH對(duì)合成替米考星雜質(zhì)H的影響

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，酒石酸酸洗對(duì)降低替米考星雜質(zhì)H效果較好，為確定酒石酸酸洗的工藝條件，首先需要確定合理pH滴加范圍，用酒石酸溶液將泰樂菌素萃取液的pH調(diào)節(jié)至不同的值，考察不同pH對(duì)替米考星雜質(zhì)H的影響。pH分別調(diào)節(jié)為6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0進(jìn)行合成替米考星。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，將酒石酸泰樂萃取液等量分為6份，加入酒石酸溶液進(jìn)行不同pH的調(diào)節(jié)，然后合成替米考星，檢測替米考星雜質(zhì)H，結(jié)果如圖：在pH=6.5～5.0時(shí)雜質(zhì)H呈下降趨勢，在pH調(diào)節(jié)至5.5～5.0時(shí)，替米考星雜質(zhì)H達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)(標(biāo)準(zhǔn)≤1.0%)且在pH=5時(shí)雜質(zhì)H最小。繼續(xù)調(diào)節(jié)pH，當(dāng)PH為4.5，4時(shí)，替米考星雜質(zhì)H逐漸增大且無法達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。因此，可確定酒石酸酸洗最佳pH為pH=5.0。

圖4 泰樂萃取液酸洗pH對(duì)合成替米考星雜質(zhì)H的影響

3.3 泰樂萃取液酸洗溫度對(duì)合成替米考星雜質(zhì)H的影響

經(jīng)上述單因素實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果，以酒石酸進(jìn)行酸洗并將萃取液的pH調(diào)節(jié)至5.0時(shí)，替米考星的雜質(zhì)H含量達(dá)到了合格標(biāo)準(zhǔn)且達(dá)到了最優(yōu)值，但在此過程中，溫度的變化對(duì)替米考星雜質(zhì)H具有顯著影響，因此，對(duì)酸洗過程中的最適溫度進(jìn)行篩選，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，隨著溫度的提升，雜質(zhì)H呈先下降后上升的趨勢，當(dāng)溫度小于35 ℃時(shí)，雜質(zhì)H均達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)，且此溫度下達(dá)到最低值為0.73，溫度大于35 ℃雜質(zhì)H均不合格，因此，可確定溫度為35 ℃為最佳的酸洗溫度條件。

圖5 泰樂萃取液酸洗溫度對(duì)合成替米考星雜質(zhì)H的影響

3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

為降低替米考星雜質(zhì)H，通過對(duì)泰樂萃取液淋洗液的選擇、酒石酸調(diào)節(jié)pH的考察及酒石酸酸洗溫度對(duì)替米考星雜質(zhì)H的考察，確定酒石酸溶液為淋洗液，確定pH=5.0，確定最適宜的酸洗溫度為35 ℃，進(jìn)行5批穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)以最終確定最佳考察條件是否穩(wěn)定。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表

表1 中所列數(shù)據(jù)為pH=5.0，酸洗溫度為35 ℃下進(jìn)行了5批穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)結(jié)果。由表1可知，當(dāng)確定了酸洗pH及酸洗溫度時(shí)，5批實(shí)驗(yàn)樣品檢測雜質(zhì)H均符合(USP)有關(guān)物質(zhì)單雜檢測標(biāo)準(zhǔn)(標(biāo)準(zhǔn)≤1.0%)。因此，可確定酸洗最佳pH=5.0，最佳的酸洗溫度條件溫度為35 ℃。

4 結(jié)語

本研究以泰樂菌素精制液為實(shí)驗(yàn)原料，經(jīng)過加入乙酸丁酯做萃取劑，加入液堿調(diào)節(jié)pH至10.0～10.5進(jìn)行萃取。所得萃取液用酒石酸進(jìn)行酸洗，調(diào)節(jié)其溶液的pH為5.0，同時(shí)控制酸洗溫度為35 ℃，合成替米考星。

檢測替米考星雜質(zhì)H，替米考星雜質(zhì)H均達(dá)到合格質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，徹底解決了替米考星合成工藝(USP)檢測法中雜質(zhì)H超標(biāo)問題。