朱霞 金益峰 張陸軍 章建梁 趙仙先 董少華

(1烏魯木齊市友誼醫(yī)院心血管內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 880049；2上海嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院普通外科；3海軍醫(yī)科大學(xué)附屬長海醫(yī)院心血管內(nèi)科)

Homocysteine induces cell cycle arrest by miR-21 targeting CDC25A in endothelial cells

ZHU Xia, JIN Yi-Feng, ZHANG Lu-Jun,etal.

Department of Cardiology, Urumqi Friendship Hospital, Urumqi 880049, Xinjiang, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the role and potential mechanism of miR-21 in homocysteine (Hcy) -induced human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).MethodsThe apoptosis and cell cycle of HUVECs treated with different concentrations of Hcy were detected by flow cytometry.RT-qPCR was used to detect the expression levels of 15 miRNA and 15 target genes of miR-21. The effect of miR-21 on the expression of cell cycle regulator (CDC25A) was detected by luciferase and Western blot.Flow cytometry was used to revealed how lentivirus induced CDC25A overexpression and miR-21 mimics affected cell cycle progression.ResultsCompared with 0 mmol/L Hcy group, the cell number and proliferation of 3 mmol/L and 5 mmol/L Hcy groups were significantly decreased (P<0.05), and cell apoptosis was significantly increased(P<0.05), B cell lymphoma(Bcl)-2 mRNA and protein levels in cells were significantly reduced in a dose-dependent manner(P<0.05). Compared with 0 mmol/L Hcy group, the expression level of miRNA-21 was significantly increased (P<0.05)and the expression level of CDC25A was significantly decreased in 3 mmol/L Hcy group. Compared with NC group, miR-21-5p level of miR-21-5p mimic group was significantly increased, CDC25A mRNA and protein expression were significantly decreased(P<0.01). Compared with miR-21-5p mimic group, the level of miR-21-5p in miR-21-5p inhibitor group was significantly decreased(P<0.01). Dual luciferase reporter assay showed that miR-21-5p mimic in experimental group significantly inhibited luciferase activity in wild-type CDC25A 3 '-UTR cells(P<0.01). The expression of CDC25A protein in 0 mmol/L and 3 mmol/L Hcy group were significantly decreased(P<0.05). Compared with blank control group, CDC25A protein level was significantly increased in CDC25A lentivirus group, and the expression of CDC25A protein was significantly decreased in CDC25A lentivirus +miR-21 mimic group(P<0.05). Compared with blank control group, the proliferation ability of CDC25A lentivirus group was significantly increased(P<0.05), and the cells resumed to enter S phase,CDC25A lentivirus +miR-21 mimic group reduced the effect of CDC25A overexpression on cell cycle progression(P<0.05).ConclusionsmiR-21 plays an important role in modulating cell cycle progression and cell proliferation by targeting CDC25A in a Hcy-induced cell and suggests new insights into the prevention of Hcy-associated cell dysfunction.

【Keywords】 Homocysteine; miR-21; CDC25A; Cell cycle; Proliferation

同型半胱氨酸(Hcy)是一種含硫的非蛋白質(zhì)氨基酸，由蛋氨酸轉(zhuǎn)化形成〔1〕。Hcy水平升高稱為高同型半胱氨酸血癥(HHcy)，Hcy被認為是動脈粥樣硬化、營養(yǎng)不良和惡性腫瘤等多種疾病的獨立危險因素，嚴重危害老年人的身體健康〔2〕。Hcy可通過多種生物學(xué)途徑影響心血管疾病(CVD)的發(fā)生，例如內(nèi)皮細胞的損傷和功能障礙〔3〕，膽固醇三酰甘油合成紊亂〔4〕，血栓紊亂〔5〕，平滑肌細胞過度增殖等〔6〕。血管內(nèi)皮細胞是血液和血管的分界，Hcy直接影響血管內(nèi)皮細胞的損傷或者功能障礙〔7〕，但是目前Hcy介導(dǎo)內(nèi)皮細胞的機制并不清楚。miRNA是由19～24個核苷酸組成的單鏈內(nèi)源性非編碼RNA，通過抑制其靶mRNA的翻譯或降解來調(diào)節(jié)基因表達〔8〕。miRNA在人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)中表達豐富〔9，10〕。有證據(jù)表明，miRNA在許多生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，包括增殖、凋亡、代謝、炎癥和衰老，并參與多種疾病的病理過程〔11〕。有研究報道Hcy在誘導(dǎo)心肌重構(gòu)過程中，通過增加核酸內(nèi)切酶水平誘導(dǎo)miRNA的差異表達〔12〕。此外，miRNA影響內(nèi)皮細胞增殖〔13〕。例如，高水平的miR-21通過復(fù)制和應(yīng)激誘導(dǎo)導(dǎo)致HUVECs細胞周期阻滯和細胞增殖抑制〔1〕。然而參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能障礙的miRNA的異常表達是否由Hcy誘導(dǎo)尚不明確。

miRNA可以通過誘導(dǎo)目的mRNA的降解或者抑制翻譯來調(diào)控基因表達。細胞周期調(diào)控因子(CDC25)雙特異性磷酸酶(DSP)有3個亞單位：CDC25A、CDC25B和CDC25C〔14〕。而CDC25A是miR-21的主要靶基因〔15〕，也是一個重要的細胞周期調(diào)節(jié)因子，通過蛋白與蛋白之間的相互作用，在激活不同的周期蛋白CDK復(fù)合物，促進染色體聚集，調(diào)控細胞周期G1/S和G2/M期的轉(zhuǎn)變等方面發(fā)揮重要的作用〔16，17〕。在多種癌細胞體系中可發(fā)現(xiàn)CDC25A高表達，其原因是增殖不可控和凋亡逃逸〔18〕。miR-21通過靶向CDC25A調(diào)節(jié)細胞周期進程引起血清饑餓〔19〕。本文主要研究在HUVECs中，miR-21的靶基因及其在細胞周期進程和增殖的作用，探究Hcy引起內(nèi)皮細胞功能障礙的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 HUVECs和HEK293T細胞從美國菌種保藏中心中獲得；杜氏改良培養(yǎng)基DMEM購自美國HyClone公司；Lipofectamine 2000試劑購自美國Invitrogen公司；miR-21 模擬物(mimic)、miR-21抑制劑(inhibitor)購自中國廣州銳博生物科技公司；細胞增殖(CCK8)檢測試劑盒、膜聯(lián)蛋白(Annexin) V-異硫氰酸熒光素(FITC)凋亡檢測試劑盒和蛋白提取試劑盒購自碧云天生物科技有限公司；Hcy購自美國Sigma公司；熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Toyobo公司；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購自丹麥Vedb?k公司；CDC25A和GAPDH抗體均購自美國abcam公司；Western印跡化學(xué)發(fā)光辣根過氧化物酶(HRP)底物電化學(xué)發(fā)光(ECL)液購自美國Millipore公司；ABI 7900型實時熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國Applied Biosystems公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和處理 HUVECs和HEK293T細胞使用杜氏改良培養(yǎng)基(包含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和1%谷氨酰胺)培養(yǎng)在37℃，5% CO2環(huán)境的濕化培養(yǎng)箱中。細胞密度達到80%～90%時，使用胰酶消化細胞傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的 HUVECs，分為Hcy組和對照組。Hcy組培養(yǎng)基中加入3 mmol/L、5 mmol/L的Hcy處理細胞，對照組加入等體積的DMEM完全培養(yǎng)液，分別標記為3 mmol/L Hcy組、5 mmol/L Hcy組、0 mmol/L Hcy組。

1.2.2CCK8試劑盒檢測細胞增殖狀況 將細胞以1×104細胞/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)基中加入不同濃度的Hcy處理細胞；24 h后每孔加入10 μl CCK8溶液，培養(yǎng)1 h，在450 nm處用酶標儀測定吸光度。每組實驗均設(shè)3個復(fù)孔，用數(shù)據(jù)平均值來反映細胞生長狀況。 轉(zhuǎn)染組細胞增殖活性檢測同上。

1.2.3細胞周期檢測 取適當濃度(1～5)×106個/ml的細胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后，使用75%的冷乙醇-20℃固定過夜。次日向細胞中加入200 μl RNaseA(300 g/ml)，加入碘化丙啶(PI)進行細胞染色，洗滌后用流式細胞儀進行細胞周期分析。

1.2.4細胞凋亡檢測 細胞凋亡檢測使用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒。使用1 ml結(jié)合緩沖液重懸約1×106個細胞，在每個樣品中加入10 μl Annexin V-FITC和10 μl PI溶液，進行流式細胞術(shù)檢測。

1.2.5熒光素酶檢測 將人源CDC25A的3′UTR全長克隆到psiCheck-2熒光素酶報告質(zhì)粒中，PCR產(chǎn)生的突變miR-21-5p使用以下引物：CDC25A-3′UTR正向：5′-ATTACTCGAGAATCTCCCAGACCCACCACT GG-3′，反向：5′-ATACGCGGCCGCCACCTCCCA CCAAATAGATATCGG-3′；CDC25A-3′UTR突變正向：5′-ATTACTCGAGTATTCGAAAATCTCCCAGAC CCACCACTGG-3′，反向：5′-TAAAGCGGCCGCCACCTCCCACCAAATAGATATCGG-3′。使用Lipofectam-ine2000試劑將CDC25A 3′UTR熒光素酶報告質(zhì)粒或?qū)φ召|(zhì)粒與15 nmol/L或30 nmol/L的miR-21 mimic共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中〔分別為15 nmol/L組和30 nmol/L組，以0 nmol/L作為對照(0 nmol/L組)〕。轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光〔20〕。

1.2.6慢病毒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 慢病毒的構(gòu)建、制備和轉(zhuǎn)染參照文獻〔21〕報道的方法。 取對數(shù)生長期的 HUVECs和HEK293T細胞，以 2×105個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)，當細胞達50%～70%融合時，使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑分別將陰性對照、miR-21 mimic、miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)染到細胞中，并分別標記為NC組、miR-21-5p mimic組、miR-21-5p inhibitor組，每組設(shè)置6個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，加入終濃度為 3 mmol/L或5 mmol/L的Hcy轉(zhuǎn)染24 h后檢測轉(zhuǎn)染效率，進行后續(xù)實驗。

為了驗證Hcy的誘導(dǎo)效應(yīng)是通過影響miR-21的水平靶向抑制CDC25A表達。分別用陰性對照Hcy、miR-21 mimic、miR-21 inhibitor、Hcy+miR-21 inhibitor處理細胞，分為NC組、Hcy組、miR-21 mimic組、miR-21 inhibitor組和Hcy+miR-21 inhibitor組。

從HUVEC cDNA文庫中擴增CDC25A的開放閱讀框序列，并使用以下引物構(gòu)建質(zhì)粒pCDHCMV-MCS-EF1-copGFP正向：5′-ACTGAATTCACCATGGAACTGGGCCCGGAG-3′，反向：5′-CGGGATCCTCAGAGCTTCTTCAGACGACTG-3′。將慢病毒重組質(zhì)粒、空載質(zhì)粒、pML-Δ8.9或pVSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中，分別為CDC25A慢病毒組、空白對照組、CDC25A慢病毒+miR-21 mimic組，制備重組慢病毒細胞株。通過計數(shù)HEK293T細胞中GFP陽性細胞比值來檢測轉(zhuǎn)染效率。慢病毒感染HUVEC細胞的病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)為10。

1.2.7實時熒光定量PCR 使用miRNeasy試劑盒提取RNA?？偭縍NA用20 μl無RNA酶的H2O洗脫，檢測260 nm波長處的OD值，測定RNA濃度。使用ReverTra Ace?qPCR RT試劑盒，將分離得到的RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物包括3.5 μl RT primer mix (每個miRNA 0.5 μl)，4 μl (5X) RT緩沖液，1 μl RT Enzyme Mix 和總RNA。用于RT-qPCR的miRNAs有miR-10a、miR-18a、miR-22、miR-21、miR-24、miR-28、miR-29b、miR-30b、miR-128、miR-140、miR-203、miR-214、miR-296、miR-425、miR-486，其對應(yīng)的上游引物序列：5′-ACACTCCAGCTGGGTACCCTGTAGATCCGAA-3′、5′-ACACT-CCAGCTGGGTAAGGTGCATCTAGTGC-3′、5′-ACAC-TCCAGCTGGGAAGCTGCCAGTTGAAG-3′、5′-ACAC-TCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA-3′、5′-ACAC-TCCAGCTGGGTGGCTCAGTTCAGCAG-3′、5′-ACAC-TCCAGCTGGGCACTAGATTGTGAGCT-3′、5′-ACAC-TCCAGCTGGGTAGCACCATTTGAAATC-3′、5′-ACA-CTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTACAC-3′、5′-ACA-CTCCAGCTGGGCGGGGCCGTAGCACTGT-3′、5′-AC-ACTCCAGCTGGGCAGTGGTTTTACCCTA-3′、5′-ACA-CTCCAGCTGGGGTGAAATGTTTAGGAC-3′、5′-ACA-CTCCAGCTGGGACAGCAGGCACAGACA-3′、5′-ACA-CTCCAGCTGGGGAGGGTTGGGTGGAGG-3′、5′-ACA-CTCCAGCTGGGAATGACACGATCACTCC-3′、5′-AC-ACTCCAGCTGGGTCCTGTACTGAGCTGC-3′；其對應(yīng)的下游引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCACAAA-3′、5′-CTCA-ACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTA-TCA-3′、5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAGTT-3′、5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACA-3′、5′-CTCA-ACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTG-TTC-3′、5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATT-CAGTTGAGTCCAGG-3′、5′-CTCAACTGGTGTCGTG-GAGTCGGCAATTCAGTTGAGAACACT-3′、5′-CTCA-ACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGC-TGA-3′、5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATT-CAGTTGAGTCTCAG-3′、5′-CTCAACTGGTGTCGTG-GAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTACCA-3′、5′-CTCA-ACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTA-GTG-3′、5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTGCC-3′、5′-CTCAACTGGTGTCGTG-GAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGAGAG-3′、5′-CTCA-ACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCA-ACG-3′、5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAAT-TCAGTTGAGCTCGGG-3′，通用下游引物序列：5′-TGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′。

RT-qPCRs使用ABI Prism7900系統(tǒng)，使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，反應(yīng)混合物中含有10 μl SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，0.5 μl正向引物(10 μmol/L)，0.5 μl反向引物(10 μmol/L)，2 μl cDNA模板，7 μl RNase-free H2O。qRT-PCR程序為95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 60 s，第二步到第四步進行40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次實驗。結(jié)果采用2-ΔΔCt計算各miRNA表達量。用于RT-qPCR的基因有CDC25A、張力蛋白同源物(PTEN)、程序性死亡因子(PDCD)4、軟脂酰化磷蛋白(SPRY)1、SPRY2、反轉(zhuǎn)錄富含半胱氨酸蛋白(RECK)、腫瘤抑制基因(TP)63、白細胞介素(IL)12A、B細胞易位基因2(BTG)、富亮氨酸重復(fù)序列相互作用蛋白(LRRFIP)1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2型受體(BMPR2)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β2、E3泛素連接酶(PELI1)、人錯配修復(fù)蛋白(MSH)2和酸性核磷蛋白(ANP)32A，上游引物序列：5′-CTCCTCCGAGTCAACAGATTCA-3′、5′-CCGGCAGCATCAAATGTTTCAG-3′、5′-ACAGGTGT-ATGATGTGGAGGA-3′、5′-GAGAGAGATTCAGCCTA-CTGCT-3′、5′-ATGGCATAATCCGGGTGCAA-3′、5′-TGTGAACTGGCTATTGCCTTG-3′、5′-GGACCAGCA-GATTCAGAACGG-3′、5′-CCTTGCACTTCTGAAGAG-ATTGA-3′、5′-ACCACTGGTTTCCCGAAAAG-3′、5′-GCTATGGTTTCCAATGCTCAGC-3′、5′-CGACAGGAGA-CCGTAAACAAGG-3′、5′-ATGGCTTGACCACTAATGGTG-3′、5′-AGGCATCCAAGGAGAATGATTG-3′、5′-CACCTCAATCGCAAACTTACCA-3′，下游引物序列：5′-CAACAGCTTCTGAGGTAGGGA-3′、5′-AACTGGCAGGTAGAAGGCAACTC-3′、5′-TTCTCAAATGCC-CTTTCATCCAA-3′、5′-GCAGGTCTTTTCACCACCGA-A-3′、5′-TGTCGCAGATCCAGTCTGATG-3′、5′-GCA-TAACTGCAACAAACCGAG-3′、5′-AGGACACGTCGA-AACTGTGC-3′、5′-ACAGGGCCATCATAAAAGAGGT-3′、5′-CTGGCTGAGTCCGATCTGG-3′、5′-GCCGCCT-AGATTCAGCCAG-3′、5′-CCATATCGACCTCGGCCA-ATC-3′、5′-CGATCTGGTTTCACGTAGGCTA-3′、5′-G-GAATCCACATACCCAACTCCAA-3′、5′-AACACATT-TTCTCGGTAGTCGTT-3′。

1.2.8Western印跡分析 用蛋白提取試劑盒提取總蛋白。Bradford法定量蛋白濃度后，取20 μg蛋白裂解液在分離膠為12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，然后用5%的脫脂牛奶常溫封閉1 h。將膜分別與含有CDC25A和GAPDH的一抗在4℃孵育過夜，用TBST洗滌后，將膜與HRP二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌后進行免疫印跡顯影檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行Wilcoxon-Mann-Whitney檢驗和t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1Hcy影響HUVEC細胞凋亡、增殖和細胞周期 與0 mmol/L Hcy組相比，3 mmol/L Hcy組、5 mmol/L Hcy組細胞增殖活性顯著下降(P<0.05),5 mmol/L Hcy組細胞增殖活性顯著低于3 mmol/L Hcy組(P<0.05)。見圖1、表1。利用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和細胞周期。與0 mmol/L Hcy組相比，3 mmol/L Hcy組、5 mmol/L Hcy組細胞凋亡顯著增加(P<0.05)，且5 mmol/l Hcy組顯著高于3 mmol/L Hcy組(P<0.05)。見表1、圖2。

與0 mmol/L Hcy組比較，5 mmol/L Hcy組顯著延遲了細胞周期G1/S向G2/M的轉(zhuǎn)換(P<0.05)。見表1、圖3。與0 mmol/L Hcy組相比，3 mmol/L Hcy組、5 mmol/L Hcy組，B細胞淋巴瘤(Bcl)-2 mRNA和蛋白水平以劑量依賴的方式顯著降低(P<0.05)。見表1和圖4。由于Hcy會導(dǎo)致細胞數(shù)量呈劑量依賴性下降，因此后續(xù)實驗采用3 mmol/L Hcy處理細胞作為實驗組，以便有足夠的細胞用于后續(xù)實驗。

2.2Hcy影響miR-21和CDC25A的表達 與0 mmol/L Hcy組相比，3 mmol/L Hcy組中miR-21和miR-203表達水平上升，miR-29b表達水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。在這3種顯著變化的miRNA中，miRNA-21變化最為明顯，顯著上升2.19倍。推測miR-21可能在Hcy誘導(dǎo)細胞功能障礙中扮演非常重要角色。與0 mmol/L Hcy組相比，3 mmol/L Hcy組MSH2和ANP32A mRNA表達水平分別下降51%和41%，而CDC25A表達水平變化最大，下降85%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。因此選擇對CDC25A進行進一步的研究。

2.3miRNA-21靶向調(diào)控CDC25A 與NC組相比，miR-21-5p mimic組細胞內(nèi)miR-21-5p水平顯著升高，CDC25A水平顯著下調(diào)(P<0.01)。與miR-21-5p mimic組相比，miR-21-5p inhibitor組細胞內(nèi)miR-21-5p水平顯著降低(P<0.01)，CDC25A水平顯著上升(P<0.05)。見表4、圖5。

表4 miR-21 mimic和miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)染HUVECs后，miR-21-5p含量和CDC25A mRNA及蛋白表達比較

CDC25A的mRNA 3′-UTR 包含miR-21-5p的互補位點。用TargetScan和miRBase預(yù)測CDC25A是miR-21-5p的一個潛在靶點。將人的CDC25A mRNA的3′-UTR片段克隆到報告質(zhì)粒中：其中1個編碼CDC25A mRNA的3′-UTR野生型(WT)序列，另1個編碼CDC25A mRNA的3′-UTR的突變(Mut)序列，該突變序列缺乏與miR-21-5p結(jié)合位點見圖6。

NC組、Hcy組、miR-21 mimic組、miR-21 inhibitor組、Hcy+miR-21 inhibitor組CDC25A蛋白表達分別為：1.00±0.09、0.31±0.02、0.54±0.04、2.14±0.02、1.27±0.13。與NC組比較，Hcy組、miR-21 mimic組CDC25A蛋白表達顯著降低(P<0.05)；miR-21 inhibitor組CDC25A蛋白表達顯著升高(P<0.01)；與miR-21 inhibitor組比較，Hcy+miR-21 inhibitor組CDC25A蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖7。

miR-21-5p mimic顯著抑制CDC25A 3′-UTR WT細胞的熒光素酶活性(P<0.05)，而對CDC25A 3′-UTR Mut細胞的熒光素酶活性影響沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。miR-21-3p mimic不能抑制CDC25A 3′-UTR的熒光素酶。見表5。

2.4miR-21調(diào)控CDC25A的表達 與0 mmol/L Hcy組CDC25A、MSH2、ANP32蛋白表達(1.00±0.13、1.00±0.15、1.00±0.09)比較，3 mmol/L Hcy組CDC25A蛋白表達(0.29±0.03)顯著下調(diào)(P<0.05)，而MSH2(0.94±0.13)和ANP32蛋白表達(1.04±0.16)下調(diào)不明顯(P>0.05)。見圖8。

2.5CDC25A過表達促進細胞增殖和細胞周期 與空白對照組(1.00±0.12)相比，CDC25A慢病毒組細胞中CDC25A蛋白水平(3.31±0.02)顯著上升，CDC25A慢病毒+miR-21 mimic組CDC25A的蛋白表達(1.26±0.40)較CDC25A慢病毒組明顯減少(P<0.05)。見圖9。與空白對照組(0.31±0.08)相比，CDC25A慢病毒組細胞的增殖能力(0.58±0.08)明顯增強(P<0.05)；而CDC25A慢病毒+miR-21 mimic組增殖能力(0.35±0.09)無明顯變化(P>0.05)。CDC25A慢病毒組與空白對照組比較，細胞恢復(fù)進入S期，也恢復(fù)了G2/M期過渡檢驗點，不影響Hcy誘導(dǎo)的細胞凋亡。CDC25A慢病毒+miR-21 mimic組降低了CDC25A過表達對細胞周期進程的影響 (P<0.05)。見圖10、表6。

3 討 論

CVD的一些生物學(xué)機制與Hcy誘導(dǎo)的生理功能障礙有關(guān)，包括內(nèi)皮細胞損傷、修復(fù)和增殖〔22，23〕。miRNAs參與調(diào)控細胞增殖、凋亡和細胞周期等過程〔24～26〕。為研究miRNA水平的變化，我們檢測了Hcy處理HUVECs后，15個miRNA的水平。其中miR-21和miR-203上調(diào)，miR-29b下調(diào)。miR-21比miR-29b和miR-203的變化更顯著。因此，推測miR-21可能在Hcy對HUVECs的影響中起到重要作用。在人類許多癌癥的上皮細胞、造血細胞、生殖細胞和神經(jīng)細胞中，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)miR-21的水平升高，這表明miR-21可能是一種致癌因子〔14〕。此前有報道稱抑制miR-21可以減緩細胞生長，延緩細胞周期，影響多種細胞系，如A172、U87、LN229和LN308的凋亡〔27〕。與之相反的研究〔15〕稱，在某些應(yīng)激條件下，miR-21水平升高可能抑制細胞增殖并影響細胞周期檢查點進展。本研究揭示Hcy處理HUVECs后，miR-21-5p通過調(diào)控CDC25A表達來抑制細胞增殖和延遲細胞周期進程的新功能。

CDC25A涉及G1/S、G2/M轉(zhuǎn)換和G2檢查點已經(jīng)被廣泛研究〔16〕，高CDC25A水平導(dǎo)致細胞過度增殖，而敲除CDC25A則影響細胞周期進程抑制腫瘤發(fā)生〔28，29〕。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達CDC25A可逆轉(zhuǎn)升高的miR-21對細胞增殖和細胞周期的影響。因此，我們提出在HUVECs中，Hcy介導(dǎo)miR-21表達上升靶向抑制CDC25A表達的機制。本研究有助于尋找治療HHcy的新策略，改善Hcy誘導(dǎo)的細胞功能障礙，減少老年病如心血管疾病和腫瘤的發(fā)生。然而，Hcy代謝物如同型半胱氨酸硫代內(nèi)酯和蛋白結(jié)合型同型半胱氨酸對人內(nèi)皮細胞功能的影響還需要進一步研究〔30〕。本研究中Hcy處理細胞后，其他關(guān)鍵靶基因是否也發(fā)生了變化尚不清楚，有待發(fā)掘。