＊王宏亮 蘇曉蕊 孫曉敏 薛婧婧 宋佳星 張曉娟

（忻州師范學院 山西 034000）

1.研究背景

谷胱甘肽（GSH）是有機體中許多小分子的重要組成部分[1]。有抵抗氧化和清除自由基的功能，作用十分重要。近年來，很多熒光探針都有了谷胱甘肽的身影。然而，在氧化應激條件下，谷胱甘肽水平經常升高，對ROS/RNS損傷的敏感性與谷胱甘肽水平密切相關。在這一方面，谷胱甘肽穩(wěn)態(tài)失調已被確定可以成為許多的指標[2-3]。鑒于這些硫醇在生物學上的重要性，我們有興趣開發(fā)合適的熒光探針，以實現(xiàn)其對谷胱甘肽的選擇性測量和定位。傳統(tǒng)的電化學方法、液相色譜法需要大量精確的樣本，且只能檢測到硫醇的總量。熒光分析法，也具有直接標記活細胞的優(yōu)點，檢測限低而且易于操作，成為當前檢測硫醇分子最被廣泛使用的一種方法[4-5]。這次實驗的主要內容是合成一種開啟型熒光探針，檢測機理是“巰基對缺電子芳環(huán)的親核取代”[6]?；诖耍覀冮_發(fā)了一種反應后發(fā)出黃色熒光的開啟型熒光探針，以9-蒽甲醛衍生物為熒光團，與2,4-二硝基苯磺酰氯發(fā)生一個反應，熒光猝滅，使目標探針分子身幾乎沒有熒光，紫外燈照射下基本看不見其發(fā)光。該探針的熒光開啟響應來自于它與谷胱甘肽的反應，加入響應物質之后，巰基本身由于非常強的親核能力，導致磺酸酯鍵極易斷裂，熒光探針的主體結構恢復，從而熒光增強[7]。

當某一指定物質，吸收了外界給它的能量之后，會釋放出不同強度、不同波長的光，就是我們所說的“熒光”[8]?？梢哉f是這一物質吸收了特定波長入射光的能量，緊接著又發(fā)出波長更長的光。物質吸收了紫外光之后可以發(fā)出紫外熒光或可見熒光，可以發(fā)現(xiàn)它們的波長變化，就是比紫外波長更長，如果是吸收了波長較短的可見光，那么就可以發(fā)射出波長變化更加大、更長的可見熒光[9]。

熒光探針是熒光性質可以隨著所處環(huán)境變化而變化的一類熒光分子。熒光探針的應用在我們的生產、生活中非常廣泛[10]。熒光探針不僅在化學應用，在生物、環(huán)境領域也發(fā)揮了很大的作用。熒光探針通常是由識別基團、熒光基團和連接體部分組成，當與被檢測物質接觸時可以看到探針熒光信號的變化，從而實現(xiàn)對被檢測物質的定性與定量。在生物化學和環(huán)境檢測研究上具有重要意義[11-12]。9-蒽甲醛衍生物是一種穩(wěn)定的光化學物質，具有良好的熒光性能，基于此我們開發(fā)了一種亮黃色的熒光探針。9-蒽甲醛衍生物與2,4-二硝基苯磺酰氯反應生成一種熒光探針，可以稱為“磺酸脂”用于檢測存在于生物活細胞中的硫醇分子。2,4-二硝基苯磺酰氯的吸電子能力很強，可以讓熒光團熒光猝滅。加入被檢測的物質以后，由于硫醇分子中的巰基的強親核作用，發(fā)生一個反應使合成的探針分子磺酸酯鍵斷裂，導致熒光探針發(fā)光主體結構恢復，熒光逐漸變強。9-蒽甲醛衍生物原料便宜易得、制備方法簡便、條件溫和，有良好的應用前景。該類材料的生產在生物與環(huán)境檢測的應用具有重要作用及意義[13]。

2.實驗部分

(1)儀器

電熱鼓風干燥箱（天津市，三水科學儀器有限公司）；數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器（上海市，予名儀器設備有限公司）；WFH2 204B型手提式紫外燈（上海精科有限公司）；循環(huán)水式真空泵（鞏義市，予華儀器有限責任公司）；Bruker AV-400型超導核磁共振儀（德國，Bruker公司）；F-4600熒光分光光度計（日本日立公司）。

(2)原料與試劑

原料：對羥基苯乙腈；4-甲基苯磺酸吡啶；3,4-二氫-2H吡喃；9-蒽甲醛；2,4-二硝基苯磺酰氯；三乙胺（以上原料均購買于薩恩化學技術（上海）有限公司，中國）；試劑：無水乙醇（99%）；二氯甲烷；四氫呋喃；氫氧化鈉（96%）（以上試劑均購買于天津歐博凱化工有限公司，中國）除特別注明以外，均未經處理直接使用。

(3)實驗內容

①合成路線

②合成步驟

A.中間體1的合成

量取對羥基苯乙腈（3g，0.014mol）和4-甲基苯磺酸吡啶（2.83g，0.011mol）于100mL茄形瓶中，加入溶劑二氯甲烷50mL，攪勻。在冰水浴條件下滴加（3.08mL，0.035mol）3,4-二氫-2H吡喃，室溫下攪拌12h。反應結束后，先用水萃取三次洗去4-甲基苯磺酸吡啶鹽，再用飽和碳酸鈉水溶液洗去未反應完的原料對羥基苯乙腈，最后，取洗滌過的有機相旋干，固體用石油醚超聲洗滌除去3,4-二氫-2H吡喃。產物自然晾干，得產物2.5g，產率為62.6%。

B.中間體2的合成

稱取9-蒽甲醛（0.5g，0.0024mol）和中間體1（0.58g，0.0026mol）于有冷凝裝置的100mL茄形瓶中，取50mL無水乙醇作溶劑，超聲10min使其充分溶解。取氫氧化鈉固體（0.097g，0.0024mol）于10mL無水乙醇中，超聲使其溶解后滴加于反應體系，室溫下攪拌過夜。反應結束后先抽濾，用水洗滌后用無水乙醇洗滌得固體，烘干后得產物0.6g，產率為61.7%。

C.中間體3的合成

稱取中間體2（0.5g，0.0012mol）于有冷凝裝置的100mL茄形瓶中，加入10mL四氫呋喃作溶劑，使其溶解后滴加濃鹽酸0.5mL，70℃下回流30min。等待反應結束后，先旋干溶劑，后加水洗滌抽濾得固體，烘干得0.3g，產率為75.9%。

D.目標產物4的合成

取中間產物3（0.16g，0.005mol）和三乙胺（0.1g，0.001mol）于100mL茄形瓶中，取二氯甲烷20mL溶劑，?。?.15g，0.00056mol）2,4-二硝基苯磺酰氯溶解于少量二氯甲烷中。將溶解后的2,4-二硝基苯磺酰氯在攪拌和冰水浴的條件下滴加于茄形瓶中，室溫攪拌3.5～5.5h。反應完畢，先用水猝滅反應，取有機相旋干得固體產物，重結晶后得純凈產物0.18g，產率為65.6%。

目標產物4的核磁表征：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 9.15(d,J=2.2Hz,1H)，9.02(s,1H),8.77(s,1H),8.67(d,J=8.7,2.3Hz,1H),8.36(d,J=8.7Hz,1H),8.25-8.17(m,2H),8.12-8.04(m,4H),7.64-7.58(m,4H),7.48-7.42(m,2H)。

3.結果與討論

(1)結構表征: 核磁共振氫譜

如圖2所示，使用核磁共振氫譜進行表征，確為目標產物。

(2)光譜性質

為了研究探針4對谷胱甘肽的檢測是否可行，我們使用紫外分光光度計和熒光分光光度計，分別作了有無谷胱甘肽時的紫外光譜圖和熒光光譜圖。研究了探針4的光譜性質。研究結果如下所示：

①紫外-可見吸收光譜

如圖3所示：取目標探針分子配制濃度為1.0×10-5mol·L-1的溶液，溶劑為二甲基亞砜（DMSO）。測得目標探針分子的紫外吸收光譜，化合物在DMSO溶液中的吸收光譜顯示出目標探針分子在391nm處有一個顯著的吸收峰。如圖4所示，加入濃度為1.0×10-5mol·L-1的谷胱甘肽30μL，此時，吸光度增大，吸收峰藍移，由原來的391nm藍移至371nm處，這是由于加入谷胱甘肽后，磺酸酯鍵斷裂，恢復為中間產物3，共軛強度增大。

②熒光發(fā)射光譜

取目標探針分子配制濃度為1.0×10-5mol·L-1的溶液，化合物以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑、在激發(fā)波長為391nm下進行熒光發(fā)射光譜的測定。如圖5所示，測得探針分子的熒光發(fā)射光譜圖中的最大吸收波長為472nm。加入濃度為1.0×10-5mol·L-1的谷胱甘肽30μL以后，最大吸收波長由472nm紅移至506nm，熒光強度增強，表明探針分子與谷胱甘肽發(fā)生了反應，對谷胱甘肽有響應。如圖6所示，隨著放置時間的增長，分別放置1min、2min、3min以及后續(xù)隨著時間加長熒光強度繼續(xù)增強的趨勢變化不大，受時間影響程度很小。

發(fā)光機制如圖7：熒光探針4在加入響應GSH后，得到了中間體3，熒光增強。

4.結論

（1）在相對溫和的條件下以9-甲醛為原料且以較高收率合成了一種磺酸脂化合物，通過核磁和質譜等分析手段對此化合物的結構進行了進一步的表征。

（2）實驗發(fā)現(xiàn)這種新型的磺酸脂在DMSO中具有良好的溶解性，在紫外吸收光譜中發(fā)現(xiàn)其具有較好的吸收強度，以此測定其在熒光中的強度。熒光圖譜表明該種物質能夠與谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸等硫醇小分子發(fā)生反應，和這為其今后在熒光探針領域的發(fā)展提供了一定的基礎。

蒽的衍生物有著相當良好的熱穩(wěn)定性，光化學穩(wěn)定性?？捎米鳠晒夤倌軋F。利用9-蒽甲醛合成此熒光探針具有很多優(yōu)勢，原料便宜易得，合成方法簡單溫和，而且提純非常容易，這一類化合物在活體細胞檢測中有許多重要的應用。