醬鹵肉制品是我國典型的傳統(tǒng)熟肉制品，是將牛肉、雞肉、鴨肉等畜禽肉及其可食副產(chǎn)品放入調(diào)制好的鹵水中燒煮而成的。因產(chǎn)品口感酥軟、風(fēng)味濃郁，食用后唇齒留香、回味無窮，而深受消費(fèi)者喜愛，各式各樣的鹵肉制品在市場、超市、小賣部等商鋪皆占有一席之地。一些商家為吸引顧客、增大銷量，在鹵制過程中添加違禁染料以增加產(chǎn)品色澤，讓食物看起來香艷可口，引起消費(fèi)者的購買欲望。其中，酸性橙Ⅱ因其色澤鮮艷、著色穩(wěn)定和價格低廉，極大可能被添加到產(chǎn)品中增色。酸性橙Ⅱ是一類偶氮染料，具有致癌作用，長期接觸這類染料會給身體健康帶來嚴(yán)重威脅。在2008年原衛(wèi)生部發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》中指明，嚴(yán)禁將酸性橙Ⅱ作為著色劑用于鹵制熟肉制品[1]。

目前酸性橙Ⅱ的檢測方法有薄層色譜法[2]、酶聯(lián)免疫法[3]、高效液相色譜法[4-6]和液相串聯(lián)質(zhì)譜法[7-8]。主要用到的前處理方式有固相小柱凈化[9-11]，分子印跡微萃取[12]、液液萃取[13]和基質(zhì)分散萃取[14-15]等。根據(jù)國家監(jiān)督抽檢細(xì)則，鹵肉制品中酸性橙Ⅱ的檢測按照SN/T 3536—2013標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，標(biāo)準(zhǔn)使用的方法是高效液相色譜法。本文將采用固相萃取柱凈化，優(yōu)化前處理?xiàng)l件，高效液相色譜法測定醬鹵肉制品中酸性橙Ⅱ的含量，建立簡便、高效、重現(xiàn)性好的檢測方法，為檢驗(yàn)部門提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（Thermo U3000）、氮吹儀（Evatros TCS）、振蕩儀（IKA）、超聲儀（Branson）、離心機(jī)（SIGMA）、渦旋振蕩器（IKA）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV 10 Auto）、pH計(jì)（梅特勒）、水浴鍋（HH-4）、超純水機(jī)（默克）。

氨水（分析純）、無水乙醇（分析純）、甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）、檸檬酸（分析純）、超純水（18.2 MΩ·cm）和石油醚（分析純）；酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品：Bepure，250 mg，96.5%；固相萃取柱：氨基陰離子交換柱（Welchrom NH2，500 mg/6 mL）、聚酰胺柱（Cleanert JXA，500 mg/6 mL）、弱陰離子交換柱（Cleanert PWAX，500 mg/6 mL）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

準(zhǔn)確稱取0.010 00 g標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勻得濃度為1 000 μg·mL-1的一級標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確移取1.00 mL的一級標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勻得濃度為100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 試劑配制

1%氨水乙醇：1 mL氨水和70 mL無水乙醇混勻，用水定容至100 mL；5%氨水乙醇：5 mL氨水和70 mL無水乙醇混勻，用水定容至100 mL；10%氨水乙醇：10 mL氨水與70 mL無水乙醇混勻，用水定容至100 mL；20%氨水乙醇：20 mL氨水與70 mL無水乙醇混勻，用水定容至100 mL；5%氨水甲醇：5 mL氨水用甲醇定容至100 mL，混勻；10%氨水甲醇：10 mL氨水用甲醇定容至100 mL，混勻；15%氨水甲醇：15 mL氨水用甲醇定容至100 mL，混勻；20%氨水甲醇：20 mL氨水用甲醇定容至100 mL，混勻；20%檸檬酸溶液：稱取20 g檸檬酸用水定容至100 mL，混勻；2%甲酸水：移取2 mL甲酸用水定容至100 mL，混勻；0.02 mol·L-1乙酸銨溶液：稱取1.54 g乙酸銨用水定容至1 000 mL。

1.2.3 樣品前處理

（1）樣品預(yù)處理：按照四分法取樣，打碎磨細(xì)，-20 ℃保存，稱樣前需恢復(fù)至室溫。

（2）稱取2 g（精確至0.001 g）樣品，加入10 mL 20%氨水-70%乙醇水，超聲10 min，振蕩10 min，8 000 r·min-14 ℃離心5 min，取出上清液，重復(fù)提取一次，合并提取液，70 ℃氮吹至5 mL左右，用20%檸檬酸調(diào)pH為8，8 000 r·min-14 ℃離心5 min，待凈化。

（3）PWAX柱依次用3 mL甲醇和3 mL 2%甲酸水活化，取全部上述樣液過柱后，依次用3 mL 2%甲酸水、3 mL甲醇淋洗，柱抽干后，用9 mL 15%氨水甲醇分3次洗脫，收集洗脫液，50 ℃氮吹干，加入2 mL水復(fù)溶，0.45 μm濾膜過濾，待測。

1.2.4 液相色譜儀條件

色譜柱：C18柱Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；波長：484 nm；流速：1 mL·min-1；流動相比例：甲醇∶0.02 mol·L-1乙酸銨溶液=65∶35；進(jìn)樣時間：15 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試劑的選擇

分別采取4種不同比例的氨水乙醇水溶液對酸性橙Ⅱ加標(biāo)樣品進(jìn)行超聲、振蕩提取，50 ℃氮吹蒸干后復(fù)溶、過膜上機(jī)。上機(jī)結(jié)果顯示1%氨水乙醇水、5%氨水乙醇水、10%氨水乙醇水提取回收率在70%～80%，而20%氨水乙醇水提取回收率在90%以上，實(shí)驗(yàn)表明20%氨水乙醇水的提取效果最佳，因此選擇20%氨水乙醇水為提取試劑。由于醬鹵肉制品蛋白質(zhì)、脂肪含量高，提取前應(yīng)先加入適量石油醚除脂，并于通風(fēng)櫥中揮干再加入提取試劑，提取后選擇低溫離心以沉淀蛋白質(zhì)，保證上樣樣液澄清，防止過柱時造成固相萃取柱堵塞。

2.2 濃縮方式的選擇

在提取試劑中加入標(biāo)液混勻后分別選擇水浴、氮吹、旋蒸方式濃縮，其中分為60 ℃、80 ℃、100 ℃水浴濃縮，50 ℃、60 ℃、70 ℃氮吹濃縮，常溫、30 ℃、40 ℃旋蒸濃縮。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，60 ℃、80 ℃水浴濃縮耗時長，回收率在50%～60%，100 ℃水浴濃縮雖然速度快但回收率只有30%；50 ℃、60 ℃氮吹耗時較長，70 ℃氮吹耗時相對較短，且3個溫度下回收率皆在90%以上；常溫、30 ℃旋蒸時間長，40 ℃旋蒸容易爆沸，加壓后沖上連接管，使樣液損失，而樣液流回雞心瓶會造成樣品間污染，不適用于該樣液濃縮。因此，選擇70 ℃氮吹為提取液濃縮方式。

2.3 固相萃取柱的選擇

固相萃?。⊿olid Phase Extraction，SPE）是目標(biāo)物通過在吸附劑填料中選擇性保留與選擇性洗脫從而實(shí)現(xiàn)凈化的一種分離技術(shù)。實(shí)驗(yàn)研究加標(biāo)樣液在相同條件下分別使用氨基陰離子交換柱（NH2）、聚酰胺柱（JXA）、弱陰離子交換柱（PWAX）3種固相小柱進(jìn)行凈化，濃縮后復(fù)溶上機(jī)。結(jié)果顯示使用氨基陰離子交換柱的回收率在20%～40%，使用聚酰胺柱的回收率在30%左右，而使用弱陰離子交換柱的回收率可達(dá)60%以上。為了進(jìn)一步分析各小柱凈化過程中對目標(biāo)化合物的保留、洗脫效果，分別收集過柱后樣液、淋洗液、洗脫液濃縮后上機(jī)，上機(jī)濃度結(jié)果見表1。

表1 溶液中酸性橙Ⅱ上機(jī)濃度結(jié)果表

分析表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，氨基陰離子交換柱對上樣樣液保留效果差，聚酰胺柱上樣后使用2%甲酸水淋洗會造成損失，而過弱陰離子交換柱后的樣液、淋洗液中均未檢出目標(biāo)物，說明該柱對目標(biāo)物的選擇性高、保留效果好，因此實(shí)驗(yàn)選擇PWAX柱作為酸性橙Ⅱ的凈化柱。

2.4 pH對固相萃取柱吸附與洗脫的影響

PWAX是一種聚合物基質(zhì)吸附劑，雖然pH適用范圍廣（0～14），但針對特定目標(biāo)物也有最適pH值，需研究上樣樣液pH對PWAX柱保留性及后續(xù)洗脫效果的影響。將上樣樣液分別調(diào)pH至2、4、6、8，上樣后，收集過柱后樣液、淋洗液，吹干后復(fù)溶上機(jī)，結(jié)果均未檢出目標(biāo)物，表明PWAX的吸附能力受pH影響小。進(jìn)一步分析洗脫液用量對洗脫效果的影響，上樣后先后使用2%甲酸水和甲醇淋洗，同時收集淋洗液，氮吹干復(fù)溶上機(jī)，結(jié)果顯示未出峰，說明淋洗不會造成損失。對上述采用4種不同pH上樣樣液的固相萃取柱分別用10%氨水甲醇進(jìn)行多次洗脫，并分別收集每次洗脫液，氮吹干復(fù)溶上機(jī)，上機(jī)濃度結(jié)果見表2。

表2 各洗脫液中酸性橙Ⅱ上機(jī)濃度結(jié)果表

分析表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)上樣樣液pH=2、pH=6、pH=8時，相同堿性的洗脫液用量相同（10 mL）的情況下，目標(biāo)化合物回收率均在70%以上，考慮到上樣前調(diào)pH至2、6時檸檬酸溶液用量大，上樣量增多，上樣時間增加，為節(jié)省實(shí)驗(yàn)時間，提高效率，上樣前調(diào)pH至8較為合適。

2.5 洗脫液的選擇

弱陰離子交換柱，洗脫液通常選用氨水甲醇進(jìn)行洗脫。為達(dá)到更好的洗脫效果，本研究采取4種濃度的氨水甲醇對固相萃取柱進(jìn)行洗脫，結(jié)果表明5%氨水甲醇、20%氨水甲醇洗脫效果一般，而10%氨水甲醇、15%氨水甲醇洗脫效果均較好，回收可達(dá)到80%以上，但10%氨水甲醇需20 mL才能將目標(biāo)物全部洗脫下來，而15%氨水甲醇只需9 mL即可將目標(biāo)物全部洗脫，相對于10%氨水甲醇用量大大減少。因此，采用15%氨水甲醇作為固相萃取柱的洗脫液。研究發(fā)現(xiàn)少量多次洗脫比單次大量洗脫效果更好，所以實(shí)驗(yàn)采用9 mL 15%氨水甲醇分3次洗脫，且每次洗脫后都要抽干小柱。

2.6 線性范圍及檢出限

分別準(zhǔn)確吸取適量酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 μg·mL-1），用水稀釋配制成濃度為 0.1 μg·mL-1、0.2 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1和 10.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照設(shè)定的液相儀器參數(shù)進(jìn)樣，以酸性橙Ⅱ色譜峰面積（y）對酸性橙Ⅱ質(zhì)量濃度（x）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得酸性橙Ⅱ的線性方程為y=0.358 3x，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9。結(jié)果表明，酸性橙Ⅱ在0.1～10.0 μg·mL-1線性良好。以3倍信噪比為檢出限（Limits Of Detection，LOD），當(dāng)取樣量為2 g時，酸性橙Ⅱ的方法檢出限為0.1 mg·kg-1，滿足檢測的要求。

2.7 回收率及精密度

為驗(yàn)證方法的可行性，稱取2 g陰性樣品，分別添加 0.1 mg·kg-1、0.2 mg·kg-1和 1.0 mg·kg-13 個濃度水平，每個水平做6個平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。酸性橙Ⅱ在3個添加水平的回收率在80.0%～97.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于5%（n=6）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有較好的回收率與精密度，滿足醬鹵肉制品中酸性橙Ⅱ測定的要求。

表3 酸性橙Ⅱ加標(biāo)回收率和精密度（n=6）結(jié)果表

2.8 實(shí)際樣品測定

對東莞市監(jiān)督抽取的30份各類醬鹵肉制品（包括醬牛肉、鹵雞翅、鹵鴨腳等）進(jìn)行檢測，均未檢出陽性樣品。雖然暫未檢出陽性樣品，但食品安全問題不容忽視，食品監(jiān)管部門仍需加強(qiáng)抽檢。

3 結(jié)論

本研究建立了固相萃取凈化、高效液相色譜測定醬鹵肉制品中酸性橙Ⅱ含量的方法。研究發(fā)現(xiàn)若在樣品提取前先加入石油醚除去油脂，過柱前先采用低溫高速離心沉淀蛋白質(zhì)，可以得到較澄清的上樣液，過固相萃取柱時，不會堵塞填料，從而提高凈化效率。經(jīng)過旋蒸、水浴兩種濃縮方式實(shí)驗(yàn)對比，發(fā)現(xiàn)70 ℃氮吹濃縮可同時處理大批量樣品，減少交叉污染，降低目標(biāo)物損失，可保證整個實(shí)驗(yàn)的高效性與準(zhǔn)確性。研究采用弱陰離子交換柱對樣液進(jìn)行凈化，可大大提高對酸性橙Ⅱ的吸附保留作用，增大洗脫液堿性與少量多次洗脫，不僅減少試劑使用量、縮短洗脫時間還能保證洗脫效果。研究通過優(yōu)化前處理?xiàng)l件，縮短實(shí)驗(yàn)時間，減少試劑使用量，而提高檢驗(yàn)工作效率。本方法便捷、高效、節(jié)能，為食品檢測部門測定醬鹵肉制品中酸性橙Ⅱ的含量提供參考。