韓君

（北京康仁堂藥業(yè)有限公司，北京 101301）

常染色體顯性多囊腎?。ˋDPKD）是最常見的單基因腎臟疾病[1]。大多數(shù)ADPKD患者出生時是健康的，但雙腎的漸進(jìn)性囊性轉(zhuǎn)化會誘發(fā)腎功能的持續(xù)下降，導(dǎo)致腎衰竭，瞬時受體電位通道相互作用多囊蛋白1（PKD1）和瞬時受體電位通道相互作用多囊蛋白2（PKD2）這兩個基因的突變導(dǎo)致ADP‐KD，這些基因的蛋白產(chǎn)物多囊素-1（PC-1）和瞬時受體電位通道多囊素-2（TRPP2）形成一個大分子復(fù)合物發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)多種信號通路以維持正常的腎小管結(jié)構(gòu)和功能[2-3]。Song X等[4]闡明了調(diào)節(jié)ADPKD中腎囊腫生長的分子途徑，F(xiàn)riedrich S等[5]對常染色體顯性多囊腎病上皮細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，數(shù)據(jù)表明包括6個重復(fù)的C3、FSTL1、PCOLCE、PCSK9、SPP1和ZFP37和8個 新 發(fā) 現(xiàn) 的CD34、CDH2、CSF2RA、DLX5、HOXC9、PIK3R1、PLCB1和TLR6基因可以為ADPKD的后續(xù)功能研究選擇目標(biāo)，Menezes LF等[6]發(fā)現(xiàn)常染色體顯性多囊腎病Pkd1-小鼠模型的網(wǎng)絡(luò)分析確定HNF4α為疾病調(diào)節(jié)因子，Zhang C等[7]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1的活性是多囊腎病中囊腫生長的驅(qū)動力，Pandey P等[8]用系統(tǒng)生物學(xué)方法確定多囊腎病進(jìn)展過程中的轉(zhuǎn)錄組重編程和候選microRNA目標(biāo)，Malas TB等[9]多囊腎病表達(dá)譜的Meta分析確定了損傷修復(fù)過程的強(qiáng)烈參與，Kunnen SJ等[10]剪切應(yīng)力處理的Pkd1（-/-）細(xì)胞和前囊腫腎的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示了參與早期多囊腎病的途徑，盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多潛在的生物標(biāo)記物。然而，ADPKD發(fā)展的分子機(jī)制還沒有被充分探索。

1 數(shù)據(jù)采集和方法

1.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理和DEGs鑒定 本實驗通過GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE7869數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，根據(jù)相應(yīng)平臺注釋信息，統(tǒng)一將探針I(yè)D轉(zhuǎn)換為gene symbol，同時剔除多個基因的探針。該數(shù)據(jù)集包括3個正常腎冠狀細(xì)胞對照樣本和13個不同大小的常染色體顯性遺傳性多囊腎病樣本（<1毫升，n=5；10~20毫升，n=5；>50毫升，n=3）。通過R軟件中的“l(fā)imma”軟件包篩選差異基因，常染色體顯性遺傳性多囊腎病DEGs篩選標(biāo)準(zhǔn)：log2轉(zhuǎn)換的倍數(shù)變化（FC）的絕對值>1且調(diào)整后的P<0.05。

1.2 ADPKD的DEGs基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析 為了系統(tǒng)地探索所鑒定的DEGs的潛在生物學(xué)功能。本研究將前200個上調(diào)和下調(diào)的差異基因納入分析，使用R軟件“clusterProfiler”包分別對上調(diào)和下調(diào)的前200個差異基因行了GO富集分析，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，分別以炫圖形式展示。WebGestalt（基于網(wǎng)絡(luò)的基因集分析工具包）是一個功能豐富的分析網(wǎng)絡(luò)工具，供研究者理解大量基因背后的生物學(xué)意義。本研究將ADPKD的DEGs輸入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG分析，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。

1.3 ADPKD的DEGs PPI的關(guān)鍵基因分析及核心模塊基因的KEGG富集分析 為了檢查DEGs的蛋白質(zhì)產(chǎn)物之間的互動關(guān)聯(lián)。本研究將1000個上調(diào)和下調(diào)明顯的DEGs輸入STRING（the Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes）數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org/）進(jìn)行PPI分析，選取得分大于0.4的基因輸入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化。應(yīng)用軟件中的Cytohubba插件對網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中各個節(jié)點(diǎn)度值（Degree）的大小，Degree越大，該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的生物功能越多。根據(jù)節(jié)點(diǎn)的Degree算出排名前10的基因，即為ADPKD的關(guān)鍵基因。本研究使用Cytoscape插件Molecular Complex Detection（MCODE）被用來探索前1000個下調(diào)和上調(diào)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中重要的模塊，其中MCODE分?jǐn)?shù)>5，度數(shù)截止值=2，節(jié)點(diǎn)得分截止值=0.2，最大深度=100，和k-core=2被用作過濾標(biāo)準(zhǔn)，最后使用R軟件“clusterProfiler”包分別對各個模塊中的基因行了KEGG富集分析，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。

1.4 評價關(guān)鍵基因的表達(dá)水平和診斷價值 從GEO數(shù)據(jù)庫獲得已發(fā)表的ADPKD數(shù)據(jù)集，用于評價八個關(guān)鍵DEGs（CD44、MMP2、FGF2、MYC、COL1A1、CAT、EGF和JUN）的表達(dá)水平。使用R軟件中的pROC包進(jìn)行ROC分析，評估這八個DEGs的診斷價值，計算了曲線下的面積（AUC）并建立了ROC曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEGs的鑒定在GSE7869數(shù)據(jù)集中，鑒定了1000個DEGs。前25個上調(diào)和下調(diào)的表達(dá)基因熱圖見圖1。

圖1 GSE7869數(shù)據(jù)集的前50個DEGs熱圖

2.2 DEGs的GO和KEGG富集度分析 在確定了上調(diào)和下調(diào)的DEGs后，進(jìn)行了富集分析。生物過程（BP）類型的富集結(jié)果顯示，上調(diào)的DEGs是明顯富集于參與跨膜受體蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶信號通路、結(jié)締組織發(fā)育、成骨細(xì)胞分化和膠原纖維組織（圖2A）；下調(diào)的DEGs富集于小分子分解代謝過程、細(xì)胞氨基酸分解代謝過程、有機(jī)酸分解代謝過程和細(xì)胞氨基酸代謝過程參與（圖2B）。對于細(xì)胞成分（CC）類型，上調(diào)的DEGs與細(xì)胞外基質(zhì)成分、血小板α顆粒、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔和基底膜有關(guān)（圖2C），而下調(diào)的DEGs則主要富集在過氧化物酶體、微體腔和基底外側(cè)質(zhì)膜（圖2D）。關(guān)于分子功能（MF）類型，上調(diào)的DEGs主要富集在纖連蛋白結(jié)合、內(nèi)肽酶調(diào)節(jié)劑活性和酶抑制劑活性中（圖2E），而下調(diào)的DEGs富集于二級主動跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、有機(jī)酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、溶質(zhì)：鈉轉(zhuǎn)運(yùn)體活性、有機(jī)陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性和主動跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性中（圖2F）。KEGG主要富集于纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、近端小管碳酸氫鹽再生、PPAR信號通路、蛋白質(zhì)消化吸收、丙酮酸代謝、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)、精氨酸生物合成和 糖酵解/糖異生（圖2G）。

圖2 GSE7869數(shù)據(jù)集的GO和KEGG富集分析

2.3 ADPKD的DEGs PPI的關(guān)鍵基因分析及核心模塊基因的KEGG富集分析 根據(jù)STRING的信息，篩選出10個中心基因（圖3A），主要包括CD44、MMP2、FGF2、MYC、COL1A1、CAT、EGF、FN1、JUN、ALB。通過MCODE插件進(jìn)行分析使3個模塊被選中，接下來，對這些模塊中的基因進(jìn)行KEGG途徑分析，模塊一中涉及的基因主要涉及PI3K-Akt信號通路、蛋白質(zhì)消化吸收和Relaxin信號通路，該模塊二中的基因與HIF-1信號通路、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)、纈氨酸及亮氨酸和異亮氨酸降解和脂肪酸降解有關(guān)，此外，該第三個模塊中的基因與PPAR信號通路、碳代謝、膽固醇代謝和丙酸代謝有關(guān)（圖3B）。

圖3 篩選出前三個模塊的富集路徑條形圖及關(guān)鍵基因分析

2.4 評價關(guān)鍵基因的表達(dá)水平和診斷價值 從GEO數(shù)據(jù)庫獲得一個外部數(shù)據(jù)集（GSE32586）。八個關(guān)鍵 基 因（CD44、MMP2、FGF2、MYC、COL1A1、CAT、EGF和JUN）被選擇在GSE32586中驗證。GSE32586數(shù)據(jù)集的基因差異表達(dá)分析顯示（圖4），JUN上調(diào)明顯，這與整合分析一致。ROC分析是一種常用的評估基因診斷價值的方法，在以前的生物醫(yī)學(xué)工作中已經(jīng)使用，GSE32586數(shù)據(jù)集的結(jié)果顯示，基因JUN對ADPKD有診斷價值（圖5）。

圖4 GSE32586數(shù)據(jù)集中八個差異表達(dá)基因的箱型圖

圖5 GSE32586數(shù)據(jù)集中選定差異表達(dá)基因的ROC曲線

3 討論

ADPKD發(fā)病率約為1/2500，屬于世界衛(wèi)生組織和歐盟規(guī)定的罕見病范疇，男女發(fā)病率相同，子代遺傳患病概率為50%[11]。在這項研究中，納入了13個不同大小的常染色體顯性遺傳性多囊腎病樣本，確定了1000個DEGs（556個上調(diào)的DEGs和444個下調(diào)的DEGs）。在ADPKD和正常樣本之間。這些基因在KEGG途徑中明顯富集，如HIF-1信號通路和PPAR信號通路等，Kocyigit I等[12]研究了常染色體顯性多囊腎病伴或無高血壓患者系統(tǒng)性琥珀酸、缺氧誘導(dǎo)因子-1α和IL-1β基因表達(dá)。有文獻(xiàn)報道PPARα異常降低影響ADPKD細(xì)胞代謝，PPARα是ADPKD小鼠囊腫進(jìn)展的調(diào)節(jié)因子，將PPARα作為治療ADPKD的新靶點(diǎn)[13]。

CD44、MMP2、FGF2、MYC、COL1A1、CAT、EGF、FN1、JUN和ALB是PPI網(wǎng)絡(luò)中的樞紐基因。李林等[14]觀察了腎臟組織中表皮生長因子（EGF）及其受體（EGFR）的表達(dá)，探討二者在多囊腎病發(fā)病過程中的作用，結(jié)果多囊腎病大鼠發(fā)病過程中存在EGF/EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活，Seeman T等[15]發(fā)現(xiàn)蛋白尿在兒童ADPKD比較常見，最常見的類型是管狀蛋白尿，它應(yīng)該在ADPKD兒童中測量。研究發(fā)現(xiàn)COL1A1和COL3A1與腎臟間質(zhì)纖維化有關(guān)，COL4A1與腎臟基底膜增厚有關(guān)[16]。Aslam N等發(fā)現(xiàn)FN1是纖維連接蛋白腎小球病家系中的一個新變型[17]，F(xiàn)N1基因突變導(dǎo)致腎小球疾病伴纖維連接蛋白沉積[18]。綜上所述，本研究推斷EGF、ALB、COL1A1、FN1可能與ADPKD發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

此外，關(guān)鍵基因的表達(dá)模式被選入已發(fā)表的數(shù)據(jù)集（GSE32586）中進(jìn)行驗證。JUN也稱為c-Jun是AP-1家族的重要成員，研究證明，c-Jun在多種腎臟損傷中均有高表達(dá)，對腎損傷的發(fā)生及轉(zhuǎn)歸發(fā)揮重要作用[19]，與基因差異表達(dá)顯示JUN上調(diào)結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，JUN在ADPKD樣本中的表達(dá)量上調(diào)，這個基因又是PPI分析中的樞紐基因。這些結(jié)果意味著JUN可能與ADPKD的潛在機(jī)制有關(guān)。然而，JUN上調(diào)對ADPKD進(jìn)展的潛在影響還需要進(jìn)一步研究。盡管本研究確定了與ADPKD相關(guān)的基因特征，但這些工作仍有局限性。本研究的結(jié)論是在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上得出的。因此，需要額外的實驗來證實本研究的結(jié)論。此外，更大的樣本量驗證也將提高結(jié)論的可靠性。此外，應(yīng)收集臨床信息以評估生物標(biāo)志物對ADPKD患者的診斷價值。最后，關(guān)鍵生物標(biāo)志物的生物學(xué)意義將在模型系統(tǒng)或細(xì)胞系中進(jìn)行研究。

綜上，本研究在ADPKD和正常樣本之間共鑒定了1000個DEGs。其中，JUN的上調(diào)可能是ADP‐KD的基因特征。然而，應(yīng)該用更大的樣本量和體內(nèi)或體外試驗進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析來證實本研究的結(jié)果。