張 展，劉 芳，陳淑慧

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528000；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院馬克思主義學(xué)院，廣東 佛山 528000）

體細(xì)胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）是一種將已分化的細(xì)胞重編程恢復(fù)其全能性，進(jìn)而生產(chǎn)與供體細(xì)胞基因型完全相同后代的無性繁殖技術(shù)。包括收集并成熟卵母細(xì)胞，供體細(xì)胞核處理，重構(gòu)胚的體外激活，胚胎的培養(yǎng)和移植等過程。豬的SCNT技術(shù)的建立在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)有廣泛的應(yīng)用。

基因編輯技術(shù)（Gene editing technology）是指利用基因工程的基本原理對動(dòng)物基因組的靶向基因進(jìn)行有目的的編碼修飾，并結(jié)合體細(xì)胞克隆和胚胎移植等技術(shù)手段，獲得經(jīng)過基因修飾的個(gè)體且可穩(wěn)定遺傳給子代的一種生物技術(shù)。此技術(shù)不僅克服了大型動(dòng)物在傳統(tǒng)育種方面存在的周期長、遺傳效力低等問題，而且在抗病性、肉質(zhì)改善、動(dòng)物福利及動(dòng)物疾病模型等研究上都有重要突破。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的基因編輯技術(shù)。文章將對豬體細(xì)胞克隆技術(shù)進(jìn)行概述，從影響其效率的因素應(yīng)用以及同基因編輯的聯(lián)系等方面進(jìn)行綜述。

1 豬SCNT概述

關(guān)于克隆豬的發(fā)展早期開始于1989年，當(dāng)時(shí)的研究者將減數(shù)分裂中期的卵母細(xì)胞中形成的致密morula或blastocys:stage共88個(gè)核移植胚胎移植到受體中繼續(xù)發(fā)育，1頭小豬出生。研究表明，細(xì)胞核在轉(zhuǎn)移到去核的、激活的減數(shù)分裂中期的卵母細(xì)胞后能夠直接發(fā)育到足月。1995年，有研究將低溫保存的原始生殖細(xì)胞作為核質(zhì)體在豬體內(nèi)進(jìn)行核移植。實(shí)驗(yàn)表明低溫保存的原始生殖細(xì)胞能夠在72 h內(nèi)進(jìn)行核重組和卵裂，或者在體外孵育到4細(xì)胞期，然后將核轉(zhuǎn)移到去核、激活（S-）或M II期卵母細(xì)胞。1997年世界首例體細(xì)胞克隆動(dòng)物——綿羊“Dolly”的誕生標(biāo)志著哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆進(jìn)入一個(gè)新的時(shí)代。然而，豬的體細(xì)胞核移植技術(shù)發(fā)展較為緩慢。美國研究員Polejaeva2000年研究并報(bào)道了從培養(yǎng)的成年體細(xì)胞群中克隆出仔豬。國內(nèi)方面，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)于1999年成功獲得體細(xì)胞克隆豬囊胚，直至2005年我國第1頭體細(xì)胞克隆豬誕生，其在國內(nèi)克隆技術(shù)發(fā)展歷程上具有里程碑意義。近年來豬的體細(xì)胞核移植技術(shù)逐漸完善，國內(nèi)越來越多的研發(fā)機(jī)構(gòu)通過體細(xì)胞克隆獲得仔豬，比如，廣西特色小型豬、巴中土豬、太湖豬等。

2 影響豬SCNT技術(shù)的因素

近年來雖然在豬的體細(xì)胞克隆上取得了不錯(cuò)的研究進(jìn)展，但是考慮其整體的效率，仍舊不理想，這主要與不同供體細(xì)胞的來源、卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量、胚胎移植操作等方面有關(guān)系。

2.1 供體細(xì)胞的影響

在體細(xì)胞克隆研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過胎兒成纖維細(xì)胞、腎臟細(xì)胞、心臟細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、成年豬皮膚成纖維細(xì)胞等成功得到了克隆豬，但是不同的供體細(xì)胞來源對體細(xì)胞克隆的效率有一定影響。潘登科等人利用胎兒成纖維細(xì)胞、成年豬耳成纖維細(xì)胞和顆粒細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核移植，結(jié)果表明，使用胎兒成纖維細(xì)胞和顆粒細(xì)胞作為核供體的重構(gòu)胚融合率（72.7%vs.81.5%）與耳成纖維細(xì)胞的對應(yīng)結(jié)果差異顯著（62.8%）；Li，Z等以3種類型的供體成纖維細(xì)胞在克隆豬的大規(guī)模生產(chǎn)中進(jìn)行了測試，結(jié)果表明使用胎兒的成纖維細(xì)胞可以顯著提高克隆胚胎的妊娠率和分娩率。Tianbin Liu等研究結(jié)果表明胎兒成纖維細(xì)胞導(dǎo)致重構(gòu)胚胎率較低（30.38%比37.94%、34.65%和34.87%），但總體效率更高。Z.Hua等利用梅山豬胎兒成纖維細(xì)胞成功克隆了克隆豬，其克隆效率優(yōu)于初生仔豬和成年豬成纖維細(xì)胞，表明核供體細(xì)胞系對梅山豬克隆胚胎的發(fā)育能力和克隆效率均有顯著影響。從以上研究結(jié)果不難看出，在克隆豬方面，雖然有多種細(xì)胞形態(tài)可以作為供體細(xì)胞進(jìn)行克隆，但是最為理想的供體細(xì)胞仍然是胎兒成纖維細(xì)胞。

2.2 受體細(xì)胞的影響

通過體外采集到的卵母細(xì)胞對豬SCNT的影響主要表現(xiàn)在其成熟后卵母細(xì)胞的品質(zhì)，在實(shí)驗(yàn)研究中通常采用體外培養(yǎng)成熟和體內(nèi)自然發(fā)育成熟的卵母細(xì)胞。理論上講，自然發(fā)育成熟的卵母細(xì)胞要比體外培養(yǎng)成熟的卵母細(xì)胞更為理想，但是體內(nèi)發(fā)育成熟的卵母細(xì)胞難以獲取且價(jià)格昂貴；體外培養(yǎng)成熟的卵母細(xì)胞雖然價(jià)格便宜、易獲取，但是移植效率低。有研究表明，以體內(nèi)和體外成熟卵母細(xì)胞作為核移植受體構(gòu)建的克隆胚胎二者的胚胎融合率和卵裂率均無顯著差異，但體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞囊胚率高于體外成熟卵母細(xì)胞。然而，在臨床試驗(yàn)或者實(shí)際應(yīng)用中仍然以體外成熟的卵母細(xì)胞作為核移植受體的主要來源。在馬的相關(guān)研究中，有研究表明，供體動(dòng)物的年齡以及細(xì)胞的儲(chǔ)存條件和時(shí)間對卵母細(xì)胞的質(zhì)量有很大影響。在克隆豬方面，有研究表明卵丘細(xì)胞會(huì)影響卵母細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽合成，影響卵母細(xì)胞成熟后的品質(zhì)。

此外，豬卵母細(xì)胞成熟的又一影響因素是卵泡液的成分。根據(jù)不同質(zhì)量的卵母細(xì)胞制訂最優(yōu)的體外成熟方案，有助于獲得較高的成熟率。有實(shí)驗(yàn)研究表明黃芩苷可以通過抑制促凋亡相關(guān)基因（Bax）mRNA，提高卵母細(xì)胞體外成熟能力和質(zhì)量。用甲基-β環(huán)糊精（CLC）預(yù)處理可以提高豬卵母細(xì)胞的存活率和成熟率。JiEunPark等發(fā)現(xiàn)軟性瓊脂糖基質(zhì)能有效抑制卵母細(xì)胞和胚胎的凋亡。

2.3 胚胎移植數(shù)量和方法對SCNT效率的影響

胚胎移植技術(shù)是影響克隆豬生產(chǎn)效率的諸多因素中最為重要的因素之一。進(jìn)行核移植后的重構(gòu)胚，融合激活，在體外培養(yǎng)后通過腹腔鏡微創(chuàng)手術(shù)、開腹手術(shù)或非手術(shù)方法等移植到代孕母豬的子宮內(nèi)，發(fā)育成為個(gè)體。肷窩部開腹手術(shù)的方法是目前應(yīng)用最多的豬胚胎移植方法，其易于學(xué)習(xí)操作簡單，但是開腹手術(shù)可能導(dǎo)致腸壁、腹膜等粘連的風(fēng)險(xiǎn)，且在手術(shù)中應(yīng)考慮的諸多因素，比如麻醉、術(shù)后護(hù)理等都會(huì)對胚胎移植的效果造成影響，不利于代孕母豬的再次利用。2014年有研究對手術(shù)法胚胎移植進(jìn)行優(yōu)化，在一定程度上提高了克隆效果。非手術(shù)方法胚胎移植最早的成功案例在1989年，但是至今仍沒有廣泛應(yīng)用，主要是因?yàn)槟肛i的子宮頸皺褶和子宮彎曲。2004年，國外某科研機(jī)構(gòu)發(fā)明了一種新的非手術(shù)胚胎移植器械，并報(bào)道其在代孕母豬的妊娠率達(dá)到70.8%，平均窩產(chǎn)仔豬6.9頭。有研究表明通過非手術(shù)子宮深部移植的產(chǎn)仔率和產(chǎn)仔數(shù)增加了更多的玻璃化胚胎的功能，且代孕母豬的胎次不影響其生殖性能，并不影響代孕母豬重新引種到豬場做種畜的繁殖潛力。以上的研究為非手術(shù)胚胎移植在豬只的廣泛應(yīng)用提供了新的可能性。

此外，豬是多胎動(dòng)物，每窩懷孕3～5胎以上才能夠維持妊娠，所以胚胎移植數(shù)目對克隆的效率起到一定的決定作用，有研究表明將過量的（250～450個(gè)）克隆胚胎移植到個(gè)體代孕者身上對提高效率并無作用，移植到個(gè)體受體上的重構(gòu)胚胎的最優(yōu)數(shù)量為200～249個(gè)。CholHoRim等研究表明，與移植150～200個(gè)或超過200個(gè)的胚胎相比，100～150個(gè)的胚胎移植導(dǎo)致懷孕率顯著升高，該研究沒有一次移植更多的胚胎作為對比，且該研究認(rèn)為與單側(cè)輸卵管移植相比，雙側(cè)輸卵管移植顯著提高了母豬繁殖效率，此結(jié)論目前尚有爭議，且雙側(cè)移植臨床上不便操作。

3 基因編輯和豬SCNT的應(yīng)用

理論上講，基因編輯技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)是不同的。近年來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)特指將外源基因轉(zhuǎn)入到受體生物中的技術(shù)，而狹義的基因編輯則相對地特指轉(zhuǎn)基因之外的對生物體基因組目標(biāo)基因的特定修飾。2002年以克隆胚胎成纖維細(xì)胞系作為核供體，用去核豬卵母細(xì)胞重建胚胎的首例基因敲除豬誕生。除了SCNT方法外，成功獲得轉(zhuǎn)基因豬的技術(shù)還有原核顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法、精子載體法等。但是，目前就整體效率而言，SCNT仍然是獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的主要方法。近年來隨著包括鋅指核酸酶技術(shù)（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)（TALENs）及CRISPR/Cas9技術(shù)等多種基因高效靶向修飾和調(diào)控技術(shù)的發(fā)展，為基因修飾豬構(gòu)建研究提供了技術(shù)支持，同時(shí)也為其在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展開更多深入的研究打下基礎(chǔ)。

豬體細(xì)胞克隆技術(shù)首先可用于畜牧業(yè)，作為一種方便、有效的方法來提高種群的質(zhì)量，加速遺傳改良；同時(shí)保護(hù)瀕危滅絕物種是體細(xì)胞克隆的另一個(gè)潛在應(yīng)用。為了達(dá)到高質(zhì)量豬肉蛋白供應(yīng)，可通過基因編輯和SCNT技術(shù)相結(jié)合培育滿足理想生產(chǎn)性能的豬，提高豬的抗病能力，改善豬肉營養(yǎng)價(jià)值和豬肉生產(chǎn)，例如：抗豬藍(lán)耳病的基因編輯克隆豬、增加對非洲豬瘟抗性克隆豬等。

其次，豬的SCNT技術(shù)和基因編輯技術(shù)相結(jié)合在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用，隨著以 CRISPR/Cas9 為主的多種CRISPR系統(tǒng)的不斷研發(fā)和改進(jìn)，基因編輯技術(shù)逐漸完善，對人類疾病動(dòng)物模型的制備有重要意義。為某些人類疾病的發(fā)病機(jī)理、病理變化、臨床癥狀以及治療等的研究提供參考。也可制作轉(zhuǎn)基因豬生物反應(yīng)器，利用膀胱、乳腺等合成人生長激素、重組蛋白、藥用蛋白和重組抗體等。自20世紀(jì)80年代中期引進(jìn)慢性免疫抑制藥物以來，臨床移植已成為終末期器官衰竭的首選治療方法之一。解決人體器官供應(yīng)有限問題的一種新方法是利用替代物種作為器官來源。出于對倫理、繁殖特性、傳染病、解剖結(jié)構(gòu)以及生理功能的考慮，并且小型豬在外科操作上更加便利，豬被認(rèn)為是主要的替代物種。通過基因編輯獲得克隆豬的心、腎等器官，可以使異物種器官移植后隨之而來的超急性排斥反應(yīng)大大降低。

4 小結(jié)

自2000年第1頭體細(xì)胞克隆豬誕生以來，雖然體細(xì)胞克隆技術(shù)不斷更新、發(fā)展，相關(guān)理論研究和技術(shù)優(yōu)化也取得長足進(jìn)展，但是目前該技術(shù)相關(guān)機(jī)制仍不明確，生產(chǎn)效率低，新生仔豬會(huì)仍出現(xiàn)器官發(fā)育異常、呼吸困難、骨骼發(fā)育不完善等先天性疾病。造成這些情況的原因有很多，例如文中所述，但普遍認(rèn)為是表觀遺傳學(xué)重編程不完全或異常造成。相信隨著SCNT技術(shù)的不斷深入研究、完善，并且隨著新的基因編輯技術(shù)的不斷創(chuàng)新，促進(jìn)基因修飾豬的研究新發(fā)展，廣泛應(yīng)用于豬的精準(zhǔn)育種以及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并取得一定的成果。