熊澤眾 葛越 王志華

【摘要】非編碼RNA是近年來腫瘤研究的熱點(diǎn)，其在多種不同疾病的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮著不同的作用。增強(qiáng)子RNA(eRNA)是從增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄過來的非編碼RNA，近年來隨著高通量測序技術(shù)(RNA-seq、ChIP-seq、ATAC-seq、RIP-seq、Hi-C等)的迅速發(fā)展，對(duì)于eRNA的研究也逐漸成為基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。eRNA在多種泌尿系腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中均有著重要的作用，并且其表達(dá)具有組織特異性，有望成為指導(dǎo)臨床診斷、治療、預(yù)后預(yù)測的分子指標(biāo)。本文簡短地總結(jié)了eRNA的產(chǎn)生、分類、分子特征、作用機(jī)制，以及其在泌尿系腫瘤中的研究進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】eRNA； 泌尿系腫瘤； 基因轉(zhuǎn)錄

增強(qiáng)子RNA(enhancer RNA, eRNA)是長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)的一個(gè)子類，它是從增強(qiáng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄而來的，其在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[1-5]。增強(qiáng)子可以控制多種細(xì)胞類型的選擇和維持，增強(qiáng)子失調(diào)也是多種癌癥背后的驅(qū)動(dòng)因素。然而，對(duì)于eRNA與泌尿生殖系腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)性的研究仍然較少。本文將從eRNA的產(chǎn)生、分子特征、分類、作用機(jī)制，以及其在泌尿系腫瘤中的研究進(jìn)展等方面來進(jìn)行闡述，以期為eRNA在泌尿生殖系腫瘤的診斷、治療方面提供一定的理論依據(jù)。

一、eRNA的產(chǎn)生

eRNA是lncRNA的一個(gè)子類，它是從增強(qiáng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄而來，其在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[1-5]。eRNA產(chǎn)生于活性增強(qiáng)子，能夠產(chǎn)生eRNA的活性增強(qiáng)子具有以下分子特征[2,4]：①具有一個(gè)開放的染色質(zhì)狀態(tài)，表現(xiàn)在存在DNA酶高度敏感的位點(diǎn)；②與轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄輔助因子的結(jié)合，包括組蛋白乙?；竝300和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB binding protein, CBP)等；③活性增強(qiáng)子區(qū)域以H3K4me1與H3K27ac的共同存在為標(biāo)志。

二、eRNA的分類

活性增強(qiáng)子可以單向或者雙向轉(zhuǎn)錄生成eRNA，這種方向性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了不同類型的eRNA。但是，由于目前的技術(shù)手段存在一定局限性，可能還存在一些未知的eRNA類型沒有被鑒定出來，使得eRNA在現(xiàn)有研究中的分類還不完全。目前發(fā)現(xiàn)的eRNA類型主要是非多聚腺苷酸化(polyA-)和多聚腺苷酸化(polyA+)的eRNA。兩者的主要區(qū)別[6-7]：①長度：polyA+ eRNA比polyA- eRNA更長；②染色質(zhì)特征：polyA+ eRNA相對(duì)于polyA- eRNA擁有較低的H3K4me1/me3組蛋白修飾比例；③方向性：polyA+ eRNA一般是從增強(qiáng)子區(qū)域單向轉(zhuǎn)錄而來，也稱1d-eRNA，而從增強(qiáng)子區(qū)域雙向轉(zhuǎn)錄的通常是polyA- eRNA，也稱2d-eRNA，后一種轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象比較常見。

三、eRNA的分子特征

由于增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物多種多樣，使得eRNA的長度不確定，但eRNA的長度一般不超過幾百個(gè)核苷酸[8]。在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcriptional start site, TSS)運(yùn)用全基因組測序的方法可以區(qū)別eRNA與lncRNA、mRNA的分子特征，eRNA與其他轉(zhuǎn)錄本的組蛋白修飾有如下差異：eRNA在TSS處擁有高水平的H3K4me1、低水平的H3K4me3、低密度的CpG，而mRNA和lncRNA在這些方面的水平則剛好相反。此外，Lam等[9]的研究表明eRNA的半衰期比mRNA和非編碼RNA短。但是通過對(duì)總的RNA聚合酶Ⅱ富集以及新生RNA轉(zhuǎn)錄本分析，發(fā)現(xiàn)eRNA與mRNA和lncRNA在TSS上有相似的轉(zhuǎn)錄起始率。相比mRNA和lncRNA而言，eRNA的表達(dá)具有極強(qiáng)的組織和細(xì)胞特異性[8]。

四、eRNA的作用模式與機(jī)制

有研究報(bào)道eRNA會(huì)影響基因表達(dá)[10-11]，eRNA影響基因表達(dá)一般存在兩種不同的模式：一種是初期形成的eRNA能夠募集其合成部位的蛋白復(fù)合物使局部活化(順式作用)；特定的eRNA已經(jīng)被證明可以通過與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase, HAT)CBP和BRD4的相互作用來發(fā)揮調(diào)控作用[12-13]，CBP是一種轉(zhuǎn)錄共刺激因子，由增強(qiáng)子活性區(qū)域轉(zhuǎn)錄而來的eRNA可以通過結(jié)合CBP以一種活性依賴的方式來刺激組蛋白的乙?；M(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄，CBP可以募集RNA聚合酶Ⅱ與增強(qiáng)子結(jié)合來促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的激活[12]。BRD4是通過與增強(qiáng)子和啟動(dòng)子上乙酰化組蛋白和非組蛋白相互結(jié)合來調(diào)控基因表達(dá)，其在炎癥和癌癥的發(fā)生、發(fā)展中起到了至關(guān)重要的作用，BRD4還能夠與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用，進(jìn)而在基因調(diào)控中發(fā)揮作用。此外，BRD4還可以在啟動(dòng)子和蛋白編碼基因內(nèi)，通過招募活性形式的正相轉(zhuǎn)錄延伸因子b(positive transcription elongation factor b, P-TEFb)以及組蛋白分子伴侶來使RNA聚合酶Ⅱ延長，進(jìn)而起到促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的作用。然而，其機(jī)制尚未完全清楚，仍有待進(jìn)一步探究[13]。另一種是eRNA可以募集遠(yuǎn)距離甚至是其他染色體上相關(guān)的蛋白復(fù)合物發(fā)揮遠(yuǎn)端調(diào)控作用(反式作用)。如：在人類前列腺癌中，一個(gè)與激肽釋放酶3(KLK3)基因相鄰的eRNA可以通過反式作用增強(qiáng)雄激素受體(androgen receptor, AR)依賴的基因表達(dá)[14-16]。eRNA調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的作用機(jī)制主要有以下幾個(gè)方面。

1.eRNA與蛋白質(zhì)相互作用調(diào)控染色質(zhì)成環(huán)：第一個(gè)機(jī)制是eRNA通過促進(jìn)染色質(zhì)成環(huán)來促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。eRNA通過與黏連蛋白和中介體復(fù)合物的相互作用增加DNA成環(huán)，從而穩(wěn)定增強(qiáng)子-啟動(dòng)子(E-P)循環(huán)[4]。多項(xiàng)研究中對(duì)eRNA的敲除表明，eRNA對(duì)于增強(qiáng)子和啟動(dòng)子相互作用的形成和穩(wěn)定至關(guān)重要。如：在前列腺癌中，eRNA通過與蛋白因子(例如：MED1)結(jié)合來調(diào)控染色質(zhì)成環(huán)[15]。在乳腺癌中，雌激素調(diào)控的eRNA可以和RAD21和SMC3結(jié)合來穩(wěn)定染色質(zhì)成環(huán)[8]。同樣，胃癌細(xì)胞中的異質(zhì)核核糖核蛋白U(hnRNPU)、結(jié)腸癌細(xì)胞中的CCCTC-結(jié)合因子(CTCF)均通過染色質(zhì)成環(huán)來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[2,15]。

2.eRNA可以直接與轉(zhuǎn)錄輔助因子相互作用以調(diào)節(jié)組蛋白乙酰化和基因激活：大多數(shù)增強(qiáng)子含有富含H3K27ac的核小體，它是被HAT CBP和p300所催化形成的。eRNA可以直接與轉(zhuǎn)錄輔助因子相互作用以調(diào)節(jié)組蛋白乙酰化和基因激活，例如：eRNA與轉(zhuǎn)錄共激活因子相互作用，與CBP/p300、BRD4結(jié)合來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[12]。Bose等[12]發(fā)現(xiàn)，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中的多個(gè)eRNA與CBP的催化HAT結(jié)構(gòu)域內(nèi)的RNA結(jié)合區(qū)結(jié)合，這有助于CBP與其底物組蛋白結(jié)合并刺激HAT活性。Rahnamoun等[13]的研究表明BRD4是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄共激活因子和致癌基因，直接與人結(jié)腸癌細(xì)胞系中的eRNA相互作用。eRNA-BRD4相互作用進(jìn)而促進(jìn)BRD4與乙?；旧|(zhì)區(qū)域結(jié)合以誘導(dǎo)炎癥基因的轉(zhuǎn)錄激活。這些研究表明，eRNA可以直接與轉(zhuǎn)錄輔助因子相互作用以調(diào)節(jié)組蛋白乙酰化和基因激活[2,12-13]。

3.eRNA通過“轉(zhuǎn)錄因子陷阱”的過程來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄：eRNA與轉(zhuǎn)錄因子相互作用使其與增強(qiáng)子區(qū)域結(jié)合增加從而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。例如：Sigova等[14]發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎干細(xì)胞中，eRNA對(duì)于將轉(zhuǎn)錄因子YY1結(jié)合在增強(qiáng)子區(qū)域起到了重要的作用。eRNA的轉(zhuǎn)錄減少阻止了YY1在增強(qiáng)子區(qū)域的結(jié)合。相反，運(yùn)用CRISPR-Cas9技術(shù)人工將特定的eRNA結(jié)合到增強(qiáng)子區(qū)域促進(jìn)了YY1與增強(qiáng)子的結(jié)合。這就表明eRNA可能直接調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子與DNA元件結(jié)合來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，而且這種調(diào)控方式對(duì)于基因的轉(zhuǎn)錄循環(huán)起到正反饋調(diào)節(jié)的作用。

4.eRNA促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ由暫停到釋放以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄延伸：RNA聚合酶Ⅱ暫停由負(fù)延伸因子(negative elongation factor, NELF)和DRB敏感性誘導(dǎo)因子(DRB sensitivity-inducing factor, DSIF)誘導(dǎo)，它們直接與RNA聚合酶Ⅱ和新生的mRNA轉(zhuǎn)錄本結(jié)合。eRNA可以通過結(jié)合延伸因子來調(diào)節(jié)靶基因啟動(dòng)子處的RNA聚合酶Ⅱ暫停與釋放，使它們遠(yuǎn)離啟動(dòng)子。Schaukowitch等[15]在小鼠的神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)，eRNA促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ由暫停的狀態(tài)釋放，eRNA通過RNA識(shí)別基序結(jié)合NELF復(fù)合物的NELF-E亞基，從而與NELF復(fù)合物結(jié)合，使其遠(yuǎn)離先前基因。在另一項(xiàng)研究中，Zhao等[16]發(fā)現(xiàn)，PSA eRNA，也稱為KLK3e，通過與P-TEFb形成復(fù)合物來促進(jìn)順式和反式基因轉(zhuǎn)錄。其他研究也已經(jīng)證明了單核細(xì)胞中eRNA(SERPINB2e和ADAMEC1e)和NELF或P-TEFb之間的相互作用[8]。這些研究共同表明，特定的eRNA通過在RNA聚合酶Ⅱ暫停與釋放過程中與延伸因子相互作用來促進(jìn)轉(zhuǎn)錄延伸[2,17-21]。

五、eRNA在泌尿系腫瘤中的研究進(jìn)展

1.eRNA與前列腺癌：在世界范圍內(nèi)，前列腺癌發(fā)病率位于男性惡性生殖腫瘤的第二位；隨著我國老齡化社會(huì)進(jìn)程加劇和人們生活方式的改變，前列腺癌已位居我國男性泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率第一位[21-22]。國內(nèi)前列腺癌患者進(jìn)入臨床干預(yù)時(shí)多數(shù)已處于進(jìn)展期或轉(zhuǎn)移性前列腺癌，對(duì)于此類患者，雄激素剝奪治療(androgen deprivation therapy, ADT)是目前最為廣泛使用的基礎(chǔ)治療方法。然而，幾乎所有的前列腺癌患者在接受一段時(shí)間ADT治療后，常常由最初的激素敏感性前列腺癌逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槿莸挚剐郧傲邢侔?castration resistant prostate cancer, CRPC)[23]。一旦進(jìn)展至CRPC階段，即使在去勢治療的條件下腫瘤細(xì)胞仍然會(huì)快速增殖并發(fā)生轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致患者死亡。有研究表明，CRPC患者中位生存時(shí)間僅為14個(gè)月[24]，因此尋找治療CRPC的新手段是很有意義的。

PSA代表了一類非傳統(tǒng)的基因，其腫瘤生物學(xué)意義不僅體現(xiàn)在其蛋白功能上，還體現(xiàn)在其他功能方面，如eRNA。在CRPC中，Zhao等[16]的研究表明，PSA基因除了作為一個(gè)生物標(biāo)志，從其增強(qiáng)子還可產(chǎn)生具有重要功能的eRNA——PSA eRNA。PSA eRNA通過順式和反式兩種作用機(jī)制，在增強(qiáng)異常AR活性和CRPC細(xì)胞活力方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。這些結(jié)果表明了有效靶向PSA eRNA用于CRPC患者治療的可能性，單獨(dú)或聯(lián)合其他抗癌藥物，如：抗雄激素藥物(比卡魯胺或恩扎盧胺)，可作為臨床CRPC治療的一種選擇。隨著其他AR-eRNA功能的揭示，可以設(shè)想聯(lián)合敲除一系列AR-eRNA可能會(huì)在更大程度上抑制前列腺癌的發(fā)展。除了順式調(diào)節(jié)PSA mRNA表達(dá)外，PSA eRNA可以反式調(diào)節(jié)參與雄激素作用的基因亞群的表達(dá)、細(xì)胞增殖、存活、生長以及遷移和侵犯。這些結(jié)果表明，通過靶向功能性AR-eRNA阻斷關(guān)鍵增強(qiáng)子的活性可能為CRPC治療開辟新的途徑[14-15]。

2.eRNA與膀胱癌：膀胱癌是常見的泌尿系腫瘤，雖然隨著醫(yī)療水平的提高，對(duì)膀胱癌的診斷、治療均取得了較大進(jìn)展。但仍有部分患者發(fā)現(xiàn)較晚，預(yù)后較差，因此迫切需要更敏感的預(yù)測預(yù)后的生物標(biāo)志物及更有效的治療方法。

雌激素在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，盡管膀胱癌大多發(fā)生在男性，但是女性患者有更加侵襲性的表型以及更低的生存率。Ding等[25]的研究表明，P2RY2是一種G蛋白偶聯(lián)嘌呤受體，并且在正常組織中廣泛存在。在膀胱癌組織中，雌激素可以誘導(dǎo)P2RY2增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄生成eRNA(P2RY2e)，參與多種生物過程的調(diào)節(jié)。研究者對(duì)38對(duì)膀胱癌和對(duì)應(yīng)的癌旁組織提取樣本RNA后，運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測P2RY2e的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果表明其P2RY2e表達(dá)水平增加，P2RY2e在膀胱癌5637細(xì)胞系中上升3.95倍，在T24細(xì)胞系中上升3.54倍；隨后通過CCK-8、Edu實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移活性，caspase-3 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)P2RY2e可以促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和抑制癌細(xì)胞凋亡，P2RY2e與膀胱癌高組織學(xué)分級(jí)、腫瘤侵襲性和高TNM分期呈正相關(guān)。以上結(jié)果表明P2RY2e可以作為膀胱癌發(fā)生和進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)因素。同樣，在Che等[26]的研究中發(fā)現(xiàn)了一種名為SMAD7的蛋白，它是可以通過多種機(jī)制來拮抗TGF-β1信號(hào)通路的一種細(xì)胞內(nèi)蛋白。其對(duì)應(yīng)的增強(qiáng)子在雌激素的刺激下可以轉(zhuǎn)錄成為功能的轉(zhuǎn)錄本——SMAD7 eRNA(SMAD7e)。SMAD7e也被證明和P2RY2e起到了相似的作用[25]。以上結(jié)果表明，P2RY2e和SMAD7e與膀胱癌的診斷、分期、分級(jí)，特別是預(yù)后密切相關(guān)，并且Cas13a-P2RY2e(SMAD7e)可能是抑制膀胱癌發(fā)展的一種有效的方法[25-26]。

3.eRNA與腎癌：腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)是最常見的腎細(xì)胞癌組織學(xué)類型，其具有很高的轉(zhuǎn)移率和死亡率。盡管ccRCC的治療方式在近年來得到了不斷的改進(jìn)，但其死亡率仍在增加。因此，必須確定有效的預(yù)后生物標(biāo)志物，以識(shí)別生存率低的高危患者。

Jiang等[27]運(yùn)用生物信息學(xué)方法確定了2 695種eRNA及其預(yù)測靶點(diǎn)，確定了EMX2OS是ccRCC中關(guān)鍵的代謝相關(guān)eRNA。使用Kaplan-Meier生存分析和相關(guān)性分析顯示，EMX2OS是與生存率顯著相關(guān)的eRNA，它與預(yù)測的靶標(biāo)EMX2具有高度的相關(guān)性；在根據(jù)年齡、性別、AJCC分期的方差分析中，年齡>60歲和≤60歲組、男性和女性組、不同AJCC分期組的方差分析結(jié)果表明，EMX2OS表達(dá)的下調(diào)與年齡(P<0.001)、性別(P<0.001)、AJCC分期(P<0.001)顯著相關(guān)。同時(shí)，與正常腎組織相比，ccRCC組織中的EMX2OS表達(dá)顯著下降，EMX2OS表達(dá)下降與臨床病理特征(較高的組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和晚期AJCC分期)顯著相關(guān)。多變量Cox回歸分析證實(shí)EMX2OS在ccRCC中發(fā)揮獨(dú)立的預(yù)后作用。為了驗(yàn)證上述結(jié)果，研究者使用來自癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)的32種其他類型癌癥的數(shù)據(jù)作為內(nèi)部驗(yàn)證數(shù)據(jù)集，并使用12對(duì)ccRCC和正常組織樣本的RT-qPCR分析作為外部實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。RT-qPCR結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了ccRCC中EMX2OS的下調(diào)，所有結(jié)果一致表明EMX2OS起到了抑制ccRCC發(fā)生、發(fā)展的作用。此外，研究者還進(jìn)行了功能富集分析，GO結(jié)果表明EMX2OS可能影響腫瘤脂肪酸和丙酮酸的代謝，KEGG結(jié)果表明其可能通過FOXO和PPAR信號(hào)通路來影響腫瘤的能量代謝和生長。因此，推測EMX2OS可能通過增加FOXO和PPAR信號(hào)通路影響能量代謝進(jìn)而影響ccRCC預(yù)后。

這項(xiàng)研究表明EMX2OS這種eRNA可能具有預(yù)測腎癌預(yù)后的作用。由于EMX2OS在能量代謝方面具有潛在的作用，也可能成為ccRCC患者新的治療靶點(diǎn)。

六、問題與展望

eRNA與泌尿系惡性腫瘤的研究仍處于初步探索階段，不同研究機(jī)構(gòu)的工作集中在一種或幾種eRNA的表達(dá)調(diào)控作用上，eRNA的調(diào)控機(jī)制尚未研究透徹。泌尿生殖系腫瘤發(fā)病受多因素影響，一種腫瘤可能與多種eRNA相關(guān)。如何快速準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)的eRNA，是首先要解決的問題。eRNA調(diào)控過程中參與的基因、蛋白，調(diào)控涉及的信號(hào)通路有待進(jìn)一步研究；eRNA在不同腫瘤中發(fā)揮著不同作用，如PSA eRNA在前列腺癌細(xì)胞中促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲[21]，在腎癌中EMX2OS則抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展[27]，其作用機(jī)制也有待研究解答。

隨著時(shí)代的發(fā)展，新的測序技術(shù)的不斷產(chǎn)生，如全基因組新生轉(zhuǎn)錄本測序(GRO-seq)、RNA純化染色質(zhì)分離結(jié)合測序(CHIRP-seq)、染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合測序(ChIP-seq)[28]、RNA免疫沉淀結(jié)合測序(RIP-seq)等，合理地運(yùn)用這些方法，也將有利于研究eRNA在泌尿系腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，有利于早日將其應(yīng)用于泌尿系腫瘤的早期篩查、診斷、分期、預(yù)后預(yù)測乃至治療。