譚慶芻 黃浩洲 羅傳紅 李 莞 莫太剛 張定堃 韓 麗 林俊芝

(1 成都中醫(yī)藥大學藥學院,西南特色中藥資源省部共建國家重點實驗室,成都,611137; 2 成都市三勒漿藥業(yè)集團四川華美制藥有限公司,成都,610045; 3 成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,代謝性疾病中醫(yī)藥調控四川省重點實驗室,成都,610072)

余甘子為大戟科植物余甘子PhyllanthusemblicaL.的干燥成熟果實,是我國西南地區(qū)的重要經(jīng)濟作物[1]。余甘子風味獨特、營養(yǎng)豐富,由于其保健功效突出,被聯(lián)合國作為保健植物進行推廣種植[2-3]。目前,全世界大約有17個國家及地區(qū)在自己的傳統(tǒng)藥物體系中使用了余甘子,在印度阿育吠陀(Ayurveda)醫(yī)學中具有很高的地位,在中國蒙古族、藏族、彝族、維吾爾族等多個民族醫(yī)學體系中高頻使用[4]。該品種1977年被載入《中華人民共和國藥典》,并列入原衛(wèi)生部“藥食同源”名單,現(xiàn)今成為西南地區(qū)鄉(xiāng)村振興的重點支撐品種。

課題組在四川、云南等地實地調研發(fā)現(xiàn),余甘子生產(chǎn)主要以鮮果榨汁為主,其生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生2種主要固廢物,一是余甘子榨汁后產(chǎn)生大量果渣,干燥重量約為鮮果的30%,單個藥企年產(chǎn)可達300噸[5],主要通過曬干后填埋處理;另一種是其鮮汁靜置過程產(chǎn)生的大量沉淀物,年產(chǎn)近百噸,主要通過生物氧化處理,環(huán)保壓力大。由于鮮果壓榨對多酚的提取并不充分,果渣中含有大量的酚類物質,具有較強的酸性與腐蝕作用,掩埋后還可能影響土壤性質。本研究首先比較研究了余甘子果渣與余甘子藥材的化學成分及含量差異,篩選了主要抑菌活性成分,以此指導余甘子果渣的最優(yōu)提取工藝,并采用Box-Behnken響應面法優(yōu)選余甘子果渣抑菌免洗凝膠的制劑處方,以期探索余甘子果渣的綜合開發(fā)途徑。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 液相色譜儀(島津公司，日本，型號:LC-2010AHLT),Milli-Q超純水儀(Millipore公司，美國，型號:Reference),振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚科技有限公司，型號:ZQLY-180V),生物安全柜(青島海爾生物醫(yī)療有限股份公司，型號:HR30-ⅡA2),低溫冰箱(合肥美菱股份有限公司，型號:BD-169C),1/10 000分析天平德國Sartorius公司，型號:BSA224S)1/100 000分析天平(Sartorius公司，德國,型號:BT25S),RE-52旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，型號:RE-52),冷凍干燥機(寧波新芝生物科技有限公司，型號:SCIENTZ-10N),質構儀(上海騰拔儀器科技有限公司，型號:Rapid TA+),pH計(濟南好來寶醫(yī)療器械有限公司，型號:PHS-3C)。

1.2 試劑 沒食子酸(成都克洛瑪生物科技有限公司，批號：CHB201131,純度≥98%),訶黎勒酸、柯里拉京、鞣花酸(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號：whq21050704、whq21040907、whq21010403;純度均≥98%)。腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基(商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司，貨號：20210601),瓊脂粉(成都科隆化學品有限公司，批號：2019081301),大腸桿菌(Escherichiacoli),批號：BNCC336902、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)，批號：BNCC337946、白念珠菌(candidaAlbicans),批號：BNCC352028購于商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司;慶大霉素(0.04 g/mL西南藥業(yè)股份有限公司，批號：230141504),其余試劑為分析級。

1.3 分析樣品 余甘子果渣樣品S1-S10,對應余甘子藥材樣品S11-S20(來源于成都三勒漿藥業(yè)在云南產(chǎn)地進行鮮果榨汁產(chǎn)生的果渣,以及課題組在云南楚雄等產(chǎn)地收集),經(jīng)成都中醫(yī)藥大學藥學院許潤春副教授鑒定為大戟科植物余甘子Phyllanthusemblica的干燥成熟果實。

2 方法與結果

2.1 余甘子果渣與余甘子藥材的化學成分比較

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Welchrom C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為0.2%磷酸水溶液-甲醇,采用梯度洗脫,洗脫程序:0～6 min,5%甲醇;6～15 min,5%～7%甲醇;15～20 min,7%～15%甲醇;20～25 min,15%～21%甲醇;25～31 min,21%～22%甲醇;31～41 min,22%甲醇;41～47 min,22%～28%甲醇;47～51 min,28%～32%甲醇;51～57 min,32%～38%甲醇;57～70 min,38%～45%甲醇;70～80 min,45%～65%甲醇;檢測波長為270 nm;體積流量為1.0 mL/min;柱溫25 ℃;進樣量10 μL[6]。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別取沒食子酸、柯里拉京、訶黎勒酸,鞣花酸對照品適量,精密稱定,分別置于容量瓶中,加50%甲醇配制質量濃度分別為0.129 mg/mL、0.072 mg/mL、0.103 mg/mL、0.180 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取余甘子果渣粉末或藥材粉末(過3號篩,下同)0.1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇50 mL,稱定質量,超聲20 min(300 W,40 kHz),放冷,加50%甲醇補足減失的質量,搖勻,過0.22 μm微孔濾膜,即得。

2.1.4 樣品含量測定 取10批余甘子果渣樣品與10批余甘子藥材樣品,按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項色譜條件進行測定,計算樣品中沒食子酸、柯里拉京、訶黎勒酸與鞣花酸的含量。

2.2 余甘子果渣中主要抑菌活性成分篩選

2.2.1 菌懸液的制備 取適量白念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種于肉湯培養(yǎng)基,白念珠菌于28 ℃培養(yǎng)48 h,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌于37 ℃培養(yǎng)24 h后采用麥氏管比濁法配成106CFU/mL的菌液,備用[7]。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取沒食子酸、柯里拉京、訶子勒酸、鞣花酸適量,用二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)定容于容量瓶中,配制成濃度分別為0.131 mg/mL、0.110 mg/mL、0.177 mg/mL、0.131 mg/mL的供試品溶液,陽性組為10 μg/mL慶大霉素。

2.2.3 活性成分最低抑菌濃度測定 取無菌96孔板,每孔加入100 μL含有0.5%2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-trihenylterzoliumchloride，TTC)無菌培養(yǎng)基,每組樣品設定3個平行對照,取100 μL供試品溶液加入每排第1孔,與培養(yǎng)基充分混合,從中取100 μL加入到第2孔中,混合均勻后再取100 μL到第3孔中,以此類推,直到第11孔,取出100 μL棄去,陽性對照為慶大霉素,陰性對照為空白DMSO培養(yǎng)基,在恒溫培養(yǎng)箱中放置24 h,根據(jù)微孔中是否具有出現(xiàn)紅色來判斷有無細菌生長,最低抑菌的濃度的判斷標準為微孔中不出現(xiàn)TTC紅色,各項操作均在無菌環(huán)境下進行[8]。

2.3 余甘子果渣提取工藝的優(yōu)化

2.3.1 提取次數(shù)考察 精密稱取適量同一批次余甘子果渣各5份,分別加入70%乙醇,固定其料液比為1∶10,回流2 h,分別提取1、2、3次,提取液經(jīng)過過濾、濃縮、定容得到供試品溶液,以篩選出的主要抑菌成分含量為指標進行篩選。

2.3.2 提取時間考察 精密稱取適量同一批次余甘子果渣各5份,分別加入70%乙醇,固定其料液比為1∶10,提取次數(shù)為1次,分別回流0.5、1、2、3、4 h,提取液經(jīng)過過濾、濃縮、定容得到供試品,以篩選出的主要抑菌成分含量為指標進行篩選。

2.3.3 乙醇濃度考察 精密稱取適量同一批次余甘子果渣各5份,分別加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇,固定料液比為1∶10,回流2 h,提取次數(shù)為1次,提取液經(jīng)過過濾、濃縮、定容得到供試品,以篩選出的主要抑菌成分含量為指標進行篩選。

2.3.4 料液比考察 精密稱取適量同一批次余甘子果渣各5份,分別加入70%乙醇,使其料液比分別為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12,回流2 h,提取液經(jīng)過過濾、濃縮、定容、干燥,得到供試品,以篩選出的主要抑菌成分含量為指標進行篩選。

2.4 余甘子果渣抑菌免洗凝膠的制備工藝優(yōu)選

2.4.1 余甘子果渣提取液的制備 按照“2.3”中篩選出的最優(yōu)提取工藝制備果渣提取液。

2.4.2 基質的篩選 凝膠劑屬局部外用制劑,根據(jù)凝膠劑的特點,處方中除主藥外,應包含凝膠基質、保濕劑、防腐劑等。參考凝膠劑的常用基質,用于制備凝膠的輔料以卡波姆U20、卡波姆U21、卡波姆940、甲基纖維素(Methyl，MC)、羧甲基纖維素鈉(Carboxymethyl Cellulose-Na,CMC-Na)等較為常用,這些凝膠材料也是常用的生物黏附材料,在體內均能生物降解,對皮膚刺激性小,制備免洗凝膠劑的關鍵是基質篩選,通過感官評價評分對基質進行篩選。

2.4.3 不同基質凝膠制備工藝篩選 稱取去離子水20 g于500 mL燒杯中,分別稱取卡波姆U20 0.4 g[9]、卡波姆U21 0.4 g[10]或卡波姆940 0.4 g[11]分散至水中待其完全溶脹,或緩慢加入MC 3 g[12]或CMC-Na 4 g[13]繼續(xù)攪拌制成凝膠,加入30 g藥液、3 g甘油、95%乙醇10 g,用TEA調pH值為5～6,攪拌均勻,純化水補重到100 g,比較5種基質的成型效果,篩選最優(yōu)成型基質。

2.4.4 響應面優(yōu)化余甘子果渣抑菌免洗凝膠處方 以各配方樣品的感官指標(包括透明度、涂展性、殘留量、膚感)及理化指標(包括黏度、黏著性、稠度、穩(wěn)定性)為評價指標,針對余甘子果渣免洗凝膠成型的主要成分果渣提取液、卡波姆U20、甘油,采取響應面設計的方法優(yōu)化處方比例。配方樣品的感官指標評分標準見表1,用量范圍見表2，響應面設計結果見表3。配方樣品的理化指標采用質構儀測定,采用A/BE-d45探頭,將觸發(fā)力設置為3 g,將探頭的前進速度設置為0.3 mm/s,接觸保持時間為10 s,在測定完成后探頭回收速度1 mm/s,將測定距離設置為10 mm,分別對不同條件下制備的余甘子果渣抑菌免洗凝膠進行質構分析,對質構分析曲線進行積分處理,黏著性(Firmness)用最小力表示,稠度由正峰面積表示;黏度指標(Index of Viscosity)以負峰面積表示,分值范圍為1～10分[14]。

表1 感官評價考察指標賦分值

表2 凝膠劑處方范圍

表3 Box-Behnken設計因素及水平

2.4.5 抑菌效果驗證 在無菌環(huán)境下進行操作,將106CFU/mL的菌懸液0.2 mL涂布在凝固的平板表面,平行3份;將5 mm濾紙片分別放置于凝膠及無菌水液體中,浸泡4 h,在生物安全柜中用無菌鑷子進行操作順時針將濾紙片均勻安置于培養(yǎng)平板中,37 ℃培養(yǎng)24 h,等待培養(yǎng)時間結束后準確測量抑菌圈直徑,計算平均值[15]。

2.4.6 工藝驗證 按響應面優(yōu)化得出最終處方同時進行3批實驗驗證,計算最終評分。

2.5 結果

2.5.1 含量測定結果 余甘子果渣樣品與余甘子藥材樣品的高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)圖譜見圖1,含量測定結果見表4。由圖譜結果可以看出,余甘子果渣與余甘子藥材的成分基本相同,但測定的4個成分含量不同,相對較低。沒食子酸在余甘子果渣中含量為0.218%～2.148%,在余甘子藥材中含量為0.991%～3.176%;柯里拉京在余甘子果渣中含量為0.004%～0.039%,在余甘子藥材中含量為0.760%～0.813%;訶黎勒酸在余甘子果渣中含量為0.063%～0.202%,在余甘子藥材中含量為0.716%～2.735%;鞣花酸在余甘子果渣中含量為0.040%～0.105%,在余甘子藥材中含量為0.394%～0.652%。余甘子鮮果在壓榨過程中,多酚類成分并未被完全提取出,部分批次果渣中殘留量較高,具有進一步開發(fā)的價值。

表4 余甘子果渣與余甘子藥材中4種活性成分的含量(%)

2.5.2 指標成分的抑菌活性篩選 訶黎勒酸、柯里拉京、沒食子酸與鞣花酸對白念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌效果見表5。由結果可知,4種指標成分對3種細菌菌株均具有一定的抑制作用,陰性組每孔均有細菌生長,說明空白溶劑對細菌生長無抑制作用。訶黎勒酸、柯里拉京、沒食子酸對3種菌種的最低抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)均低于10 μg/mL,其中訶黎勒酸的抑菌效果最強,而鞣花酸的MIC為16.38～32.75 μg/mL,明顯弱于其他3種,故后續(xù)提取工藝優(yōu)化選擇沒食子酸、訶黎勒酸與柯里拉京含量作為評價指標。

表5 4種活性成分MIC(μg/mL)

2.5.3 提取工藝的考察結果 提取次數(shù)篩選結果如圖2A,由結果可知,隨著提取次數(shù)的增加,有效成分提取總量變化不明顯,這可能是果渣中的有效成分在第一次提取時就基本上被提取完成,從控制成本的角度考慮,提取次數(shù)定為1次。提取時間的篩選結果如圖2B,隨著提取時間的延長,提取總量逐漸增多,在2 h時出現(xiàn)峰值,之后繼續(xù)延長提取時間,提取總量反而減少,這與訶黎勒酸、柯里拉京長時間受熱后的降解有關,沒食子酸的不斷增加也是訶黎勒酸不斷水解的結果[5]。故確定最優(yōu)提取時間為2 h。乙醇濃度篩選結果如圖2C,隨著乙醇濃度的升高,3種成分的提取率均出現(xiàn)增高,但是在乙醇濃度達到70%后,總含量隨著醇濃度的增加而呈現(xiàn)下降趨勢,故確定70%的醇濃度為最優(yōu)提取濃度。料液比篩選結果如圖2D,料液比對提取量有重要影響,在料液比為1∶4、1∶6時提取物含量較低,在達到1∶10后,提取總量變化不大,總體呈現(xiàn)料液比越高,提取物總量越高的趨勢,故確定最優(yōu)料液比為1∶10。綜上所述，優(yōu)選出的提取工藝為“取余甘子果渣,加入10倍體積的70%乙醇,回流2 h,提取1次,提取液經(jīng)濾過、定容得到供試品”。

2.5.4 基質的選擇結果 凝膠劑的基質考察結果見表6。由結果可知,當選擇MC或CMC-Na作為凝膠基質時,加入藥液后凝膠體系易發(fā)生絮凝而渾濁,且使用時較為油膩,涂展性差,在手背殘留量較大,穩(wěn)定性不好。而選擇卡波姆系列作為凝膠基質時,整體感官明顯優(yōu)于MC或CMC-Na,膚感清爽且保濕持久。實驗中發(fā)現(xiàn),以卡波姆U20為基質時,制備出的凝膠顏色金黃且透明度良好,使用清爽不油膩,相對最優(yōu),故采用卡波姆U20作為余甘子果渣抑菌免洗凝膠的基質。

表6 不同基質考察結果

表7 Box-Behnken響應面設計實驗安排及結果

2.5.5 Box-Behnken優(yōu)化處方結果 基質處方的Box-Behnken響應面設計實驗安排及結果見表7。由結果可知,隨著卡波姆、甘油、藥液比例的變化,凝膠性質的綜合得分明顯不同,在54.56～76.54之間波動。利用軟件Design-Expert 12.0分析對表中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析,得到基質綜合評分與各因素變量的二次方程模型為Y=74.94+2.15×A+0.616 7×B-3.75×C-0.222 5×AB-1.22×AC-0.260 81×BC-4.50×A2-2.19×B2-10.53×C2,回歸方程模型方差分析結果如表8,不同卡波姆、藥液、甘油用量對綜合評分交互影響的等高線及響應面如圖3所示,此模型具有顯著性(F=41.40,P=0.000 4<0.05)。失擬項不顯著(P=0.611 2>0.05),說明該二次方程能夠較好地擬合真實水平,實驗失誤小,可用此模型對余甘子果渣免洗凝膠基質進行預測。模型一次項A、C顯著,B不顯著,交互項BC顯著,AC、AB不顯著,二次項A2、C2顯著B2不顯著,根據(jù)F值可知各基質用量對余甘子果渣免洗凝膠處方量的綜合評分影響程度為C>A>B,即果渣提取液用量>卡波姆用量>甘油用量。

表8 回歸模型方差分析結果

各項指標綜合結果評分曲面得出的最佳處方組成為:30%果渣提取液、0.4%卡波姆、3%甘油、4%的95%乙醇、三乙醇胺調pH值到5～6,其為純化水,余甘子免洗凝膠綜合評分為74.93。同時進行3批驗證實驗,平均值73.88,相對標準偏差(Relative Standard Deviation，RSD)值為0.39%,表明該優(yōu)化制劑處方穩(wěn)定可靠。

2.5.6 抑菌效果驗證 使用優(yōu)化工藝制備的余甘子果渣抑菌免洗凝膠,驗證對金黃色葡萄球菌、白念珠菌、大腸桿菌的抑菌效果。結果發(fā)現(xiàn),余甘子果渣抑菌免洗凝膠對金黃色葡萄球菌、白念珠菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為1.12 cm、1.15 cm、1.00 cm;陽性組為慶大霉素,對3種細菌的抑菌圈直徑分別為1.30 cm、1.42 cm、1.40 cm。上述結果表明,余甘子果渣抑菌免洗凝膠具有較好的抑菌效果。

3 討論

本研究通過化學成分比較,證明了余甘子鮮果榨汁后得到的果渣具有與余甘子藥材相同的組成、可提取的多酚及其開發(fā)利用的價值。通過對4種指標成分的抑菌活性比較,發(fā)現(xiàn)沒食子酸、柯里拉京、訶黎勒酸具有較好的抑菌活性。有研究表明,沒食子酸能改變金黃色葡萄球菌細胞膜的滲透性完整性,明顯抑制金黃色葡萄球菌胞可溶性蛋白的表達[16],而訶黎勒酸是一種有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑,對鮑曼不動桿菌的生長活動具有明顯抑制作用[17]。在體外培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn),將柯里拉京加入到培養(yǎng)基中可減少青霉素結合蛋白(Penicillin-binding Protein2a，PBP2a)的產(chǎn)量[18],同時柯里拉京在一定程度上抑制了β-內酰胺酶活性,可顯著性增強β-內酰胺類抗生素如苯唑西林、頭孢美唑的抗耐甲氧西林金葡菌作用。由于在回流過程中,訶黎勒酸首先產(chǎn)生1分子柯里拉京和1分子的訶子次酸,柯里拉京則繼續(xù)水解生成沒食子酸[19-20],推測這2種成分的抑菌機制與沒食子酸相似,也是通過破壞細菌細胞膜的完整性以及抑制菌體蛋白質產(chǎn)生,或者改變細胞膜的通透性引起胞質外滲等方式表達抑菌作用。

進一步通過優(yōu)化提取工藝及凝膠劑基質配方,得到了余甘子果渣抑菌免洗凝膠。見圖4。該品呈金黃色,質地細膩,有均勻光澤,表面無氣泡,涂在手背上可均勻涂開,涂展性好。其pH值為5.87～5.98,與人體皮膚pH值相似,符合抑菌凝膠要求。離心30 min后凝膠性狀無明顯變化,證明具有較好的穩(wěn)定性。依據(jù)《2019版消毒產(chǎn)品衛(wèi)生安全評價技術要求》,對產(chǎn)品的質量相關項進行研究,初步建立余甘子果渣免洗凝膠質量標準,為后期余甘子果渣抑菌免洗凝膠的產(chǎn)品開發(fā)上市提供研究基礎。