白丹妮，魏喜紅，沈夢婷，王慶偉，蘇 瑾

（佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江省新藥創(chuàng)制與藥效毒理評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江佳木斯 154007）

失眠是臨床常見睡眠障礙之一，我國流行病學(xué)研究顯示，有45.4%被調(diào)查者曾經(jīng)歷過不同程度的失眠，失眠不僅影響生活質(zhì)量，同時常伴隨其他健康問題［1-4］。研究表明，失眠與多種精神疾病、代謝綜合征、高血壓和冠心病等慢性病有密切關(guān)聯(lián)［5-9］。交泰丸由黃連和肉桂兩味藥組成，該組方見于《韓氏醫(yī)通》［10］，方中黃連味苦氣寒，肉桂味辛性熱，兩藥相伍，使心腎相交、水火相濟(jì)，是治療心腎不交型失眠的經(jīng)典方劑［11，12］。但由于黃連生物堿水溶性差、易受腸道P-糖蛋白外排作用影響，且肉桂中主要成分肉桂醛性質(zhì)不穩(wěn)定，導(dǎo)致交泰丸的口服生物利用度低，影響其藥效的發(fā)揮［13，14］。自微乳給藥系統(tǒng)（self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS）通過將藥物包裹在油相中，使其口服后可自發(fā)分散形成O/W 型微乳，能夠有效提高藥物的生物利用度，是難溶性藥物的優(yōu)良載體［15，16］。本文以失眠模型大鼠為研究對象，比較灌胃給予交泰丸自微乳與混懸液在失眠大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)，考察劑型優(yōu)化對生物利用度的影響，為其藥效研究和臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

黃連（河北美康藥業(yè)有限公司，批號1901097），黃連總生物堿（實(shí)驗(yàn)室自提）；荷葉堿對照品（批號MUST-17035501）、鹽酸小檗堿（批號MUST-16111115）、鹽酸藥根堿（批號MUST-19072609）、鹽酸黃連堿（批號MUST-19052111）、鹽酸巴馬?。ㄅ朚UST-17022604）（成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%）；肉桂油（江西恒誠天然香料油有限公司，批號20170301）；聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH40，德國BASF 公司）；對氯苯丙氨酸（PCPA，上海源葉生物科技有限公司，批號J01S7E20295）；無水乙醇、濃硫酸、氯化鈉、無水氯化鈣（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純）；甲酸、甲醇、乙腈（美國Thermo 公司，色譜純）。

1.2 儀器

U3000-Q Exactive型UPLC-MS/MS（美國Thermo公司）；Sartorius XP105 電子分析天平（德國賽多利斯股份公司）；TGL-16G 臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；D10-12 氮吹儀（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.3 動物

健康雄性SD 大鼠，16 只，每組8 只，體重（200± 20）g，由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK（吉）-2018-0007。動物實(shí)驗(yàn)已獲得佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

飼養(yǎng)條件：適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，每4 只1 籠進(jìn)行分裝飼養(yǎng)，保持12 h 晝夜節(jié)律，室溫18～25 ℃，自由攝食飲水。

1.4 方法

1.4.1 交泰丸自微乳的制備 取黃連粉末10 g 置于圓底燒瓶，加稀硫酸100 mL，70 ℃水浴回流提取2 h，抽濾，加適量無水CaCl2于濾液中，靜置1 h，抽濾，加適量NaCl 于濾液中，4 ℃保存12 h。抽濾，濾渣烘干（50 ℃，2 h），得黃連生物堿，收集，備用。

參照課題組前期實(shí)驗(yàn)優(yōu)化處方，精密稱取肉桂油、RH-40、無水乙醇各0.28、1.03、0.67 g，加入適量黃連總生物堿提取物，渦旋均勻5 min，4 ℃儲存，備用。采用UPLC-MS/MS，測得交泰丸自微乳中4種生物堿含量分別為小檗堿7.67 mg/g，黃連堿2.13 mg/g，巴馬汀1.09 mg/g，藥根堿1.35 mg/g［17］。

1.4.2 交泰丸混懸液制備 精密稱取等量黃連生物堿提取物，與肉桂油按處方比例混合后，加入適量的生理鹽水混勻，4 ℃儲存，備用。

1.4.3 動物造模與給藥 16 只大鼠隨機(jī)分為交泰丸混懸液組和交泰丸自微乳組，每組8 只。實(shí)驗(yàn)前將大鼠置于干凈飼養(yǎng)籠中適應(yīng)3 min，觀察其2 min內(nèi)自發(fā)活動時間、雙前肢抬起次數(shù)，并以此為行為基線［18］。采用PCPA 腹腔注射法制備失眠模型，給藥劑量為350 mg/kg，連續(xù)注射4 d［19］。確認(rèn)造模成功后，禁食不禁水12 h，兩組按照黃連總生物堿80 mg/kg 劑量分別給予交泰丸自微乳或混懸液［20］，于給藥前及給藥后0.083、0.167、0.333、0.667、1、1.5、2、4、6、8、10、12 和24 h 眼眶取血0.30～0.50 mL 于肝素鈉化的離心管中，離心（4 ℃，3 500 r/min，15 min），分離血漿，-20 ℃保存待測［21］。

1.4.4 溶液的配制 精密稱取5.22 mg 小檗堿、4.99 mg 黃連堿、5.50 mg 巴馬汀、5.02 mg 藥根堿，甲醇定容至10 mL，制成濃度分別為0.52、0.20、0.20和0.20 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。用甲醇稀釋各儲備 液至6 個不同濃 度（HB1-6），4 ℃保存。濃度見表1。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中4 種標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（ng/mL）Tab 1 Concentration of four standard products in mixed standard solution（ng/mL）

1.4.5 血漿中4 種生物堿的含量測定方法

1.4.5.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相：0.1%甲酸-純凈水（A）-0.1%甲酸-乙腈（B）；體積流量：0.3 mL/min；柱溫：20 ℃，進(jìn)樣量：5 μL，線性梯度洗脫程序如表2。

表2 線性梯度洗脫程序Tab 2 Linear gradient elution procedure

1.4.5.2 質(zhì)譜條件 采用ESI 正離子檢測，單離子檢測掃描（SIM）與平行反應(yīng)監(jiān)測掃描（PRM）；檢測對象小檗堿m/z=336.122 6，黃連堿m/z=320.091 6，巴馬汀m/z=352.154 2，藥根堿m/z=338.138 2，荷葉堿（內(nèi)標(biāo)）m/z=296.131 9；鞘氣壓力35 bar，毛細(xì)管電壓3.5 kV，輔助氣壓力10 bar；加熱（蒸發(fā)）溫度350 ℃；離子傳輸管溫度320 ℃。

1.4.5.3 血漿樣品前處理 向100 μL 血漿中加入4 倍量甲醇，渦旋1 min，靜置15 min，離心（4 ℃，13 000 r/min，15 min），取400 μL 上 清 液，用 氮 氣（40 ℃）吹干，加入100 μL 甲醇超聲30 min 溶解，取上清液，進(jìn)樣分析。

1.4.5.4 專屬性考察 對空白血漿、（混合標(biāo)準(zhǔn)品+空白血漿）、灌胃后的血漿樣品分別進(jìn)樣分析，考察是否存在內(nèi)源性干擾。

1.4.5.5 線性關(guān)系及定量限 取10 μL 不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入到90 μL 空白大鼠血漿中，混勻，按“1.4.5.3”項(xiàng)下方法處理樣品，進(jìn)樣分析，得回歸方程與線性范圍。

1.4.5.6 精密度 以大鼠空白血漿配置低、中、高3個濃度的質(zhì)控樣品，按“1.4.5.3”項(xiàng)下方法操作，連測5 次計(jì)算日內(nèi)精密度，測定5 d 以計(jì)算日間精密度。

1.4.5.7 準(zhǔn)確度 以大鼠空白血漿配置低、中、高3個濃度的質(zhì)控樣品（n=6），按“1.4.5.3”項(xiàng)下方法操作進(jìn)樣，計(jì)算樣品中小檗堿、黃連堿、巴馬汀、藥根堿實(shí)測濃度，以實(shí)測濃度與標(biāo)示濃度的百分比表示準(zhǔn)確度，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）。

1.4.5.8 穩(wěn)定性 以大鼠空白血漿配置低、中、高3個濃度的質(zhì)控樣品（n=6），將樣品室溫放置24 h，進(jìn)樣檢測，考察室溫放置穩(wěn)定性；將樣品反復(fù)凍融3 次（凍融1 次至少1 d）后，進(jìn)樣檢測，考察凍融穩(wěn)定性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用DAS 2.0 計(jì)算藥動學(xué)參數(shù)，SPSS 17.0 獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠自發(fā)活動實(shí)驗(yàn)

造模后兩組大鼠2 min 內(nèi)自發(fā)活動時間、雙前肢抬起次數(shù)均顯著增加（P＜0.05），表明建立失眠模型成功。見表3。

表3 各組大鼠自發(fā)活動實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=8，±s）Tab 3 Autonomous activity of rats in each group（n=8，±s）

表3 各組大鼠自發(fā)活動實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=8，±s）Tab 3 Autonomous activity of rats in each group（n=8，±s）

注：與造模前比較，*P＜0.05，△P＜0.05。

組別自微乳組混懸液組造模前造模后活動時間（s）27.83±5.38 27.50±3.50前肢離地次數(shù)3.16±0.98 2.83±0.75活動時間（s）39.00±5.69*38.33±4.50*前肢離地次數(shù)4.50±0.84△3.67±1.03△

2.2 4 種生物堿質(zhì)譜分析

本實(shí)驗(yàn)條件下，小檗堿、黃連堿、巴馬汀、藥根堿的二級質(zhì)譜圖，見圖1。

根據(jù)圖1 確定小檗堿、黃連堿、巴馬汀、藥根堿4種成分的m/z分別為336、320、352、338。

2.3 專屬性考察

UPLC-MS/MS 結(jié) 果 表 明，4 種 生 物 堿 的Rt 分別為小檗堿1.40 min、黃連堿1.24 min、巴馬汀1.14 min、藥根堿1.30 min，分離良好，各成分保留時間處未見干擾，表明該方法專屬性強(qiáng)，見圖2。

2.4 線性關(guān)系及定量限

回歸方程及定量限見表4，結(jié)果表明，4 種生物堿在設(shè)定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r＞0.999 5，定量限為0.06 ng/mL。

表4 4 種生物堿的回歸方程及定量限Tab 4 Regression equations and quantitative limits of four alkaloids

2.5 精密度

精密度結(jié)果見表5，結(jié)果表明，4 種生物堿的日間和日內(nèi)精密度RSD＜10%，滿足測定生物樣品要求。

表5 4 種生物堿在大鼠血漿中的精密度（n=5，±s）Tab 5 Precision of four alkaloids in rat plasma（n=5，±s）

表5 4 種生物堿在大鼠血漿中的精密度（n=5，±s）Tab 5 Precision of four alkaloids in rat plasma（n=5，±s）

成分質(zhì)量濃度（ng/mL） 日間精密度Mean±SD 0.068±0.002 7.542±0.675 501.315±7.689 0.049±0.001 1.541±0.144 182.108±3.857 0.057±0.001 1.576±0.122 185.020±4.064 0.060±0.002 1.281±0.079 180.472±6.114 RSD 2.94 8.95 1.53 2.86 9.34 2.12 2.46 7.78 2.20 3.08 6.17 3.39小檗堿黃連堿巴馬汀藥根堿0.06 7.59 506.31 0.06 1.45 178.73 0.06 1.47 183.64 0.06 1.47 182.55日內(nèi)精密度Mean±SD 0.093±0.002 7.623±0.358 502.682±5.461 0.053±0.002 1.677±0.102 180.637±3.664 0.068±0.001 1.645±0.110 183.824±3.761 0.070±0.002 1.361±0.081 179.404±4.854 RSD 2.37 4.70 1.09 2.83 6.08 2.03 1.76 6.69 2.05 2.71 5.95 2.72

2.6 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度結(jié)果見表6，結(jié)果表明，4 種生物堿回收率均在85%～115% 范圍內(nèi)，滿足測定生物樣品要求。

表6 4 種生物堿在大鼠血漿中的準(zhǔn)確度（n=6，±s）Tab 6 Accuracy of four alkaloids in rat plasma（n=6，±s）

表6 4 種生物堿在大鼠血漿中的準(zhǔn)確度（n=6，±s）Tab 6 Accuracy of four alkaloids in rat plasma（n=6，±s）

成分小檗堿黃連堿巴馬汀藥根堿質(zhì)量濃度（ng/mL）0.06 7.59 506.31 0.06 1.45 178.73 0.06 1.47 183.64 0.06 1.47 182.55回收率97.28±2.26 100.89±2.32 97.69±1.18 93.91±1.77 104.92±2.72 102.01±1.93 94.40±2.13 107.44±1.75 101.05±2.11 102.52±2.97 94.15±2.62 99.39±1.17 RSD 2.32 2.30 1.21 1.88 2.59 1.89 2.26 1.63 2.09 2.89 2.78 1.17

2.7 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性結(jié)果見表7，結(jié)果表明，4 種生物堿樣品在2 種存放條件下具有較好的穩(wěn)定性，RSD＜10%，滿足測定生物樣品要求。

表7 4 種生物堿在大鼠血漿中的穩(wěn)定性（n=6，±s）Tab 7 Stability（in room temperature for 24 h，three freeze-thaw cycles）of four alkaloids in rat plasma（n=6，±s）

表7 4 種生物堿在大鼠血漿中的穩(wěn)定性（n=6，±s）Tab 7 Stability（in room temperature for 24 h，three freeze-thaw cycles）of four alkaloids in rat plasma（n=6，±s）

成分質(zhì)量濃度（ng/mL） 室溫24 h Mean±SD 0.059±0.002 7.479±0.407 502.605±6.484 0.057±0.001 1.513±0.094 181.710±2.709 0.048±0.001 1.578±0.029 184.849±2.887 0.063±0.001 1.259±0.039 180.625±3.324 RSD 2.48 5.44 1.29 2.46 6.21 1.49 2.52 1.89 1.56 1.67 3.12 1.84小檗堿黃連堿巴馬汀藥根堿0.06 7.59 506.31 0.06 1.45 178.73 0.06 1.47 183.64 0.06 1.47 182.55凍融3 次Mean±SD 0.051±0.002 7.641±0.525 499.788±7.661 0.054±0.001 1.514±0.102 181.893±2.710 0.042±0.001 1.531±0.120 184.405±4.351 0.059±0.001 1.302±0.041 181.459±2.337 RSD 2.94 6.87 1.53 2.84 6.74 1.49 2.86 7.85 2.36 1.75 3.15 1.29

2.8 藥時曲線

交泰丸混懸液及其自微乳在失眠大鼠體內(nèi)小檗堿、黃連堿、巴馬汀、藥根堿的藥時曲線如圖3所示。

2.9 藥代動力學(xué)參數(shù)

4 種生物堿藥代動力學(xué)參數(shù)如表8 所示，與混懸液組相比，自微乳組小檗堿、黃連堿、巴馬汀、藥根堿 的Cmax、AUC0-t和AUC0-∞均 極 顯 著 增 加（P＜0.01）。交泰丸自微乳組在失眠大鼠體內(nèi)小檗堿、黃連堿、巴馬汀、藥根堿的Cmax分別為混懸液組的1.46、1.18、1.83、1.38 倍，AUC0-t分別為2.39、2.22、2.04、2.27 倍，AUC0-∞分別為2.25、2.14、2.05、2.11倍，生物利用明顯提高。

表8 4 種生物堿藥動學(xué)參數(shù)（n=6，±s）Tab 8 Pharmacokinetic parameters of four alkaloids（n=6，±s）

表8 4 種生物堿藥動學(xué)參數(shù)（n=6，±s）Tab 8 Pharmacokinetic parameters of four alkaloids（n=6，±s）

注：同一成分與混懸液組比，**P＜0.01。

AUC0-∞（ng·mL-1·h-1）298.67±52.04 672.70±72.55**68.19±13.24 146.04±25.01**34.74±7.75 71.49±18.67**34.23±5.68 72.25±9.54**成分小檗堿黃連堿巴馬汀藥根堿組別混懸液自微乳混懸液自微乳混懸液自微乳混懸液自微乳Cmax（ng/mL）283.44±1.51 412.68±28.45**58.05±0.87 68.65±3.92**18.61±1.97 34.06±3.13**29.49±1.73 40.60±1.22**Tmax（h）1.00±0.00 0.50±0.00 1.00±0.00 0.50±0.00 1.00±0.00 0.50±0.00 1.00±0.00 0.50±0.00 t1/2（h）3.50±0.69 3.64±0.42 5.26±0.26 6.29±0.90 5.61±0.45 5.81±0.38 5.59±0.44 6.09±0.35 AUC0-t（ng·mL-1·h-1）263.23±2.31 628.51±14.55**58.33±0.46 129.59±4.93**28.26±0.99 57.76±2.20**28.95±1.21 65.64±2.71**

3 討論

失眠動物模型造模方法主要有物理法和化學(xué)制劑刺激法。本研究通過腹腔注射PCPA 制備失眠大鼠模型，相較其他方法（硒化物、5-羥色胺受體拮抗劑等）［22，23］，PCPA 法造模方法簡便、快速，其致失眠的機(jī)制為通過抑制色氨酸羥基化從而阻斷5-HT 的合成，降低了大鼠腦內(nèi)和外周血中的5-HT 濃度［24］。本實(shí)驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)模型大鼠自主活動時間及前肢離地舉次數(shù)均顯著增加，表現(xiàn)為白天活動不停，易嘶叫、攻擊、驚怒，與文獻(xiàn)報道一致［25］。在中醫(yī)病癥的研究中，往往并非單一因素所致，欲達(dá)到所述“心腎不交”，有報道可輔以不同的焦慮刺激后再進(jìn)行PCPA 腹腔注射，因此，更加符合中醫(yī)病證的造模方法尚需不斷摸索和改進(jìn)［26］。

本文選取雄性大鼠開展交泰丸自微乳在失眠大鼠的體內(nèi)藥動學(xué)研究，參考文獻(xiàn)報道方法并經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定雄性大鼠造模后狀態(tài)更為穩(wěn)定。交泰丸由黃連、肉桂兩味藥按照10∶1 的配比制成，是經(jīng)典的治療失眠的中藥方劑［27］，黃連中含多種化學(xué)成分，如黃酮、苯丙素類、甾體、揮發(fā)油、萜類、生物堿等，具有抗菌、調(diào)血脂、抗心律失常及催眠等廣泛藥理活性［28，29］。體內(nèi)藥動學(xué)研究結(jié)果顯示，設(shè)計(jì)為自微乳給藥體系后，交泰丸中小檗堿、黃連堿、巴馬汀、藥根堿4 種生物堿在大鼠體內(nèi)的相對生物利用度均顯著提高，t1/2均有延長，亦增加了成分體內(nèi)滯留時間。藥物的體內(nèi)吸收除了與其本身的溶解度有關(guān)外，還與其透膜能力、胃腸道環(huán)境有關(guān)。自微乳粒徑較小，更易透過胃腸壁水化層，增加胃腸道上皮細(xì)胞膜的通透性［30］，從而達(dá)到了促進(jìn)藥物胃腸道吸收，提高藥物溶出程度的效果，同時自微乳處方中乳化劑及助乳化劑除具有改善細(xì)胞膜流動性，增加膜滲透性的作用外，還能夠抑制腸道P-糖蛋白對黃連生物堿的外排作用，有效提高藥物成分的吸收［31］。

作者貢獻(xiàn)度說明：

蘇瑾副：提供本文的選題及實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)，并對論文提出修改意見；白丹妮：負(fù)責(zé)完成數(shù)據(jù)分析及論文撰寫；魏喜紅：承擔(dān)體內(nèi)樣品分析及動物實(shí)驗(yàn)部分，沈夢婷：負(fù)責(zé)協(xié)助完成實(shí)驗(yàn)；王慶偉：協(xié)助進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理分析。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。