文│林旭埜 李其昌 鄒偉斌 林梓棟 劉洪強(qiáng) 張淵魁 （江西博美萊生物科技有限公司）

自20世紀(jì)90年代暴發(fā)藍(lán)耳病以來，藍(lán)耳病（PRRS）一直是導(dǎo)致全球養(yǎng)豬業(yè)蒙受巨大經(jīng)濟(jì)損失的重大疫病。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，對藍(lán)耳病病毒（PRRSV）及機(jī)體抗PRRSV的免疫機(jī)理研究的不斷深入，通過便捷、經(jīng)濟(jì)、有效的方法預(yù)防、控制、凈化藍(lán)耳病不久將成為現(xiàn)實。

一、PRRS自身具有被免疫凈化的特點

藍(lán)耳病學(xué)名“豬繁殖與呼吸障礙綜合征”，英文名Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，簡稱PRRS。PRRS的主要表現(xiàn)有四個方面：

（1）母豬主要表現(xiàn)為繁殖障礙綜合征（Reproductive Syndrome）特征性臨床表現(xiàn)是母豬懷孕后期的流產(chǎn)，母豬的返情、復(fù)配、死胎、木乃伊胎的比例也比正常水平高。

（2）生長育肥豬及成年豬主要表現(xiàn)為呼吸障礙綜合征（Respiratory Syndrome），特別是在9～12周齡的仔豬，感染豬的呼吸道問題突出。

（3）PRRSV還可以導(dǎo)致消化道疾病，如仔豬腹瀉，最近報道的類NADC-34，主要導(dǎo)致感染仔豬的腹瀉。

（4）PRRS 還是免疫缺陷疾病。PRRSV主要侵害免疫系統(tǒng)、破壞免疫功能，導(dǎo)致機(jī)體的免疫抑制，使感染豬容易并發(fā)或繼發(fā)其他病原體感染，如圓環(huán)病毒、豬肺炎支原體、巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌、鏈球菌等。由此，PRRSV也成為豬呼吸道疾病綜合征（Porcine Respiratory Disease Complex, PRDC）的主要病原之一；免疫抑制還可以導(dǎo)致其他疫苗免疫效果降低甚至免疫失敗，如豬瘟疫苗、口蹄疫疫苗和偽狂犬疫苗等。

豬只感染PRRSV后，機(jī)體就發(fā)生了一系列的免疫學(xué)變化。有研究表明，PRRSV感染豬只后，很快就在體內(nèi)復(fù)制，不久就能在血液中檢出，病毒血癥持續(xù)時間大約1個月；組織內(nèi)病毒存續(xù)時間比在血液中要長，大約5個月；病毒感染不久機(jī)體即產(chǎn)生抗體反應(yīng)，ELISA 總抗體維持1年左右；中和抗體在感染后4周產(chǎn)生，維持時間3～5個月；γ-干擾素產(chǎn)生細(xì)胞出現(xiàn)在感染后4周，維持時間1年甚至更長。

圖1 豬只感染PRRSV后的系列免疫學(xué)變化

此外，還有資料更詳細(xì)分析了機(jī)體感染PRRSV后5周內(nèi)發(fā)生的系列免疫學(xué)變化：感染豬血液中的病毒載量比組織中的高，病毒血癥維持5周左右，感染后前4周組織內(nèi)的病毒載量比血液低，其存續(xù)時間比在血液中長；與病毒感染同時出現(xiàn)的是NK細(xì)胞，1周后達(dá)到峰值，4周后下降到正常水平；樹突細(xì)胞反應(yīng)和局部T細(xì)胞反應(yīng)在感染后2～3天出現(xiàn)，分別在感染1周和2周后達(dá)到最高水平，隨后緩慢下降；外周血T細(xì)胞反應(yīng)在感染后2周多出現(xiàn)，5周后達(dá)到峰值，隨后緩慢下降；中和抗體在感染后3周多出現(xiàn)。

圖2 豬只感染PRRSV后的系列免疫學(xué)變化自然條件下，“豬只感染PRRSV后，病毒血癥4周左右消失、組織內(nèi)的病毒5個月左右消失”，說明PRRS具有一定的自愈能力（這一點和偽狂犬病PR不同，豬只感染PRV后終身帶毒，不能通過疫苗免疫的方法清除體內(nèi)病毒，以達(dá)到抗原陰性的目的）。由于一頭豬所受的影響因素少而且簡單，PRRSV感染豬只的自愈是存在的?，F(xiàn)實情況不是一頭豬，而是一群豬，一個群體。

圖2 豬只感染PRRSV后的系列免疫學(xué)變化

因為群體（豬群）所受影響因素較多且復(fù)雜，如群體的健康狀況、群體的特異性免疫力水平、群體中個體之間的差異、群體的流動頻率，感染的季節(jié)，所感染的病毒株、病毒毒力、和病毒的傳播速度以及減少其他病原微生物感染壓力所采取的措施（如生物安全措施及藥物保健）等。因此，豬群的PRRS流行過程相當(dāng)復(fù)雜、周期更加漫長。同為PRRS陽性豬群，有的損失大、有的損失小，有的流行周期長、有的周期短，就是這原因。

從流行病的控制上分析，免疫的目的就是提高群體的免疫力水平，縮小個體之間的差異，干預(yù)群體疫病的感染、發(fā)生、發(fā)展、流行和轉(zhuǎn)歸，縮短疫病的流行周期。理論上，如果疫苗能夠提升群體免疫力水平，縮小群體中個體間的差異，清除群體機(jī)體內(nèi)的病原，縮短疫病流行周期，這個疫病就可以通過疫苗免疫的方法去凈化。

二、PRRSV有主要免疫保護(hù)相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白

從PRRSV的結(jié)構(gòu)示意圖可以看出，核衣殼（N）蛋白位于病毒顆粒中心，與核酸相連，病毒表面的囊膜上還有基質(zhì)蛋白M，小囊膜蛋白E，多聚蛋白GP2、GP3、GP4、GP5，還有GP5/M二聯(lián)體，GP2a/E/GP3/GP5多聯(lián)體。這些結(jié)構(gòu)蛋白與病毒侵入宿主細(xì)胞有關(guān)。多聚蛋白GP5不直接與宿主細(xì)胞CD163受體（PRRSV的主要受體）相互作用，因此，GP5本身并不決定病毒對宿主細(xì)胞的取向。但GP5通過與M蛋白形成（GP5+M）二聯(lián)體，影響 GP2-GP3-GP4多蛋白復(fù)合物的構(gòu)象，間接影響病毒與宿主細(xì)胞CD163受體結(jié)合，進(jìn)而影響病毒穿透細(xì)胞膜、進(jìn)入細(xì)胞而引發(fā)感染。

圖3 GPS與宿主細(xì)胞CD163受體間的關(guān)系

三、PRRSV有病毒中和表位（Epitope）

有研究表明，PRRSV主要中和表位位于GP5的外結(jié)構(gòu)域上。GP5蛋白由200個氨基酸組成，其表位是構(gòu)象表位；中和表位的最小抗原性區(qū)域，核心的氨基酸是第39～59段?；|(zhì)蛋白M由190個氨基酸組成，GP5與 M蛋白通過二硫鍵形成二聚體，保證了GP5上中和表位的構(gòu)象。

此外，GP5蛋白上還存在誘騙表位(Decoy Epitope)。個別糖基化氨基酸遮蔽了中和表位，使得PRRSV在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的時間慢，且抗體水平低，容易逃避宿主的免疫清除。中和抗體在體外對病毒的中和作用大打折扣，不能真實反映中和抗體的滴度和在體內(nèi)的實際作用。

圖4 GP5-M蛋白上的中和表位（Epitope）

四、PRRSV感染后機(jī)體能產(chǎn)生病毒中和抗體（GP5+M蛋白抗體）

有研究表明，GP5+M蛋白在病毒侵入宿主細(xì)胞時發(fā)揮重要作用，GP5+M蛋白抗體可抑制病毒感染細(xì)胞，具有病毒中和作用，也稱病毒中和抗體。病毒侵入機(jī)體，在其繁殖過程中產(chǎn)生大量GP5+M蛋白，由于多聚糖屏蔽作用，感染早期幾乎很少誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，但1個月后也能誘導(dǎo)較高水平的GP5+M蛋白抗體；普通滅活疫苗，GP5+M蛋白的抗原表位被多聚糖屏蔽，沒有暴露，幾乎不能產(chǎn)生中和抗體。GP5+M蛋白抗體可用HIPRA試劑盒檢測 IRPC值。

五、實驗室檢測方法區(qū)分PRRS滅活疫苗免疫與PRRS活病毒感染

PRRSV感染后還有一個很重的核衣殼（N）蛋白抗體。核衣殼（N）蛋白位于病毒顆粒中心，與核酸相連?；畈《厩秩牒?，在宿主細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，病毒核酸大量復(fù)制，同時生產(chǎn)大量N蛋白，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的N蛋白抗體。而滅活疫苗中的疫苗毒已經(jīng)失活，它不感染宿主細(xì)胞、不繁殖、核酸也不復(fù)制。因此，N蛋白含量極低，幾乎不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生N蛋白抗體，即便產(chǎn)生，其水平也極低、消失也很快。所以，N蛋白抗體，又稱感染抗體，可用IDEXX ELISA 試劑盒檢測其S/P值，根據(jù)S/P值大小判斷豬只感染與否或感染輕重。當(dāng)豬群的S/P≥2.0的樣本數(shù)超過10%時，表明豬群藍(lán)耳病活躍；2.0＞S/P≥0.4，表明豬群藍(lán)耳病陽性穩(wěn)定；S/P＜0.4，表明豬群藍(lán)耳病陰性。

由此可知，N蛋白抗體是區(qū)分滅活疫苗免疫與活病毒感染重要抗體，可以通過實驗室檢測鑒別滅活疫苗免疫和活病毒感染，類似于PRV（gE/gI）基因缺失活疫苗的檢測：PRRS的N蛋白抗體類似于PRV的gE/gI抗體，用于判斷是否有活（野）毒感染；PRRS的GP5+M蛋白抗體類似于PRV的gB抗體，用于判斷免疫豬的免疫保護(hù)力水平。

六、PRRS可以通過疫苗免疫得以凈化

綜上所述，如果有一款能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平細(xì)胞免疫力和體液免疫力，可以高效清除感染豬體內(nèi)的病毒，且能區(qū)分疫苗免疫與活毒感染的滅活疫苗，PRRS是完全可能通過疫苗免疫的方法得以凈化。

PRRS凈化的標(biāo)準(zhǔn)是“PRRS雙陰標(biāo)準(zhǔn)”，即抗原陰性、感染抗體陰性。抗原陰性，就是不能從組織和血液中分離到病毒顆粒，或檢測到病毒核酸（用RT-PCR檢測）；感染抗體陰性，就是病毒的核衣殼（N）蛋白抗體陰性，愛德士ELISA S/P比值＜0.4。

根據(jù)PRRS凈化的標(biāo)準(zhǔn)要求，設(shè)計一款能用于PRRS凈化的滅活疫苗也是完全可能的。因為，目前生物技術(shù)特別是基因工程技術(shù)、蛋白工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)、疫苗佐劑技術(shù)的發(fā)展迅猛，新技術(shù)新工藝不斷涌現(xiàn)，提高制苗病毒滴度的技術(shù)和工藝也已成熟，讓病毒結(jié)構(gòu)蛋白表面的抗原位點充分暴露以提高抗原性的工藝技術(shù)日臻完善，針對PRRS抗病免疫特點設(shè)計開發(fā)出能同時增強(qiáng)細(xì)胞免疫力和體液免疫力的“同步增強(qiáng)”疫苗佐劑也已成為現(xiàn)實。