劉松奇，吳京京，向慧，安建輝，周志，鄧伶俐*

1(超輕彈性體材料綠色制造民委重點實驗室(湖北民族大學)，湖北 恩施，445000) 2(湖北民族大學 生物科學與技術學院，湖北 恩施，445000)

靜電紡絲技術是一種利用靜電場力作用高分子聚合物制備納米級和微米級纖維的技術，因操作簡單、成本低、非熱技術而廣為食品領域所接受。目前，已有大量研究通過該技術以蛋白質(zhì)和多糖為聚合物基質(zhì)制備納米纖維，包封類胡蘿卜素、維生素、礦物質(zhì)、植物甾醇、多不飽和脂肪酸、精油等生物活性成分[1]。MAFTOONAZAD等[2]利用豌豆分離蛋白-聚乙烯醇負載肉桂醛應用于抗菌墊料，所得納米纖維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定均勻，同時負載1%肉桂醛的納米纖維對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有顯著抑制作用。李娟等[3]采用靜電紡絲技術制備負載百里香酚的玉米醇溶蛋白/阿拉伯膠納米纖維抗菌膜，玉米醇溶蛋白與百里香酚質(zhì)量比為5∶1時，納米纖維微觀結(jié)構(gòu)良好，具有良好的疏水性與緩釋性。然而研究表明基于傳統(tǒng)靜電紡絲設備制備纖維的產(chǎn)率較低，特別是針對一些天然高分子物質(zhì)，通常流速不超過2 mL/h，濃度低于35%[4]。由此，WU等[5]提出氣流輔助能有效提升靜電紡絲效率，主要是在傳統(tǒng)靜電紡絲設備基礎上，增添供氣系統(tǒng)并優(yōu)化噴頭結(jié)構(gòu)。電紡效率的提高是由于聚合物在氣流與靜電力的共同作用下，加速拉伸分裂，迅速向接收器偏移。

肉桂醛是從肉桂精油中提取的常見揮發(fā)性醛類生物活性物質(zhì)，能夠抑制微生物的生長繁殖，被稱為天然抑菌劑。已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration)歸類為一般公認安全(Generally Recognized as Safe，GRAS)[6]。然而其應用受限于易揮發(fā)、疏水、不良氣味等特性。課題組前期研究表明明膠/玉米醇溶蛋白質(zhì)量比為1∶1時納米纖維形貌結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、機械性能、潤濕性能較好[7]。本文選用該比例作為負載肉桂醛的納米纖維體系，以研究不同濃度肉桂醛對氣體輔助靜電紡絲納米纖維微觀形貌和宏觀性質(zhì)及生物活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肉桂醛、明膠、分析純乙酸，阿拉丁試劑(上海)有限公司；玉米醇溶蛋白(Z3625)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ)，Sigma-Aldrich公司；大腸桿菌 ATCC 25922、金黃色葡萄球菌 CMCC(B)26003，北京生物保藏中心。其他試劑均來自國藥集團化學試劑有限公司。

JDF05型靜電紡絲機，長沙納儀儀器科技有限公司；無油空氣壓縮機，臺州市奧突斯工貿(mào)有限公司；SU-8010掃描電子顯微鏡，日本日立公司；DR-508A電腦試驗拉力機，東莞市東日儀器有限公司；STA449F3DSC/TG同步熱分析儀，德國NETZSCHN；傅里葉紅外光譜儀，BRUKER光譜儀器公司；高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺，上海滬凈醫(yī)療器械有限公司；BSA124S電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；Infinite 200 PRO酶標儀，瑞士Tecan；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2 溶液配制和納米纖維制備

1.2.1 溶液配制

將150 g/L明膠，150 g/L玉米醇溶蛋白溶解于80%乙酸水溶液中，然后分別加入明膠-玉米醇溶蛋白總質(zhì)量0%、0.1%、0.5%、1.0%(質(zhì)量分數(shù))的肉桂醛，分別簡寫為C0、C0.1、C0.5、C1.0，攪拌均勻，超聲除氣泡，制得樣品。

1.2.2 氣體輔助靜電紡絲

將明膠/玉米醇溶蛋白/肉桂醛溶液注入10 mL注射器，在注射泵推動下以10.0 mL/h的速率推進到達針尖(內(nèi)徑0.5 mm)，啟動高壓電源發(fā)生器激發(fā)直流高壓電場，打開氣閥使氣流速度穩(wěn)定在300 L/h，靜電紡絲電壓為20 kV，紡絲距離為15 cm。

1.3 納米纖維表征

剪取納米纖維膜經(jīng)真空噴金處理后，于掃描電子顯微鏡上觀察納米纖維的微觀形貌。使用軟件Nano Measure從納米纖維的掃描電子顯微鏡圖中隨機選取不少于40根纖維，對其直徑進行統(tǒng)計，根據(jù)所得數(shù)據(jù)擬合得出纖維平均直徑并計算標準差。

從納米纖維膜上剪取一小塊樣品直接進行測試。掃描范圍：4 000～400 cm-1，分辨率2 cm-1，累加32次，以空氣為背景，每次掃描前扣除背景。

利用差示掃描量熱/熱重同步熱分析儀(differential scanning calorimetry/thermogravimetry，DSC/TG)對納米纖維膜進行熱特性分析。準確稱取6～10 mg樣品放入鋁坩堝中，密封。以10 ℃/min的升溫速度從30 ℃升溫至600 ℃。整個過程均在干燥N2下進行。

將納米纖維膜剪成直徑6 cm，厚度均勻的圓片狀，封于盛有10 mL透水杯口，每隔1 h稱重并記錄，每個樣品重復3次記錄6 h。水蒸氣透過率(water vapor permeability,WVP)按公式(1)計算：

(1)

式中：Ws/t，質(zhì)量隨時間的線性回歸，g/s；A，納米纖維與水蒸氣的接觸面積，cm2；L，厚度，cm；ΔP，飽和蒸氣壓差，Pa(2 237.8 Pa，28 ℃)

將納米纖維膜剪成5 cm×1.5 cm，厚度0.1 mm左右，利用DR-508A電腦試驗拉力機進行機械性能測試。納米纖維膜放入夾具，精確測量并輸入樣品的厚度、寬度、截距，拉力載荷為5 N，拉伸速率為5 mm/min，每個樣品重復5次。

1.4 抗氧化性分析

1.4.1 DPPH法

參考王存堂等[8]的方法。稱量5.0 mg樣品置于10 mL離心管中，平行3次，加入2 mL 500 μmol/L DPPH乙醇溶液避光反應30 min，在517 nm處測定吸光度。按公式(2)計算自由基清除率：

(2)

式中：A0，對照組吸光度；A1，樣品組吸光度。

1.4.2 亞鐵能力還原法(ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)

參考張巧騫[9]的方法。將0.3 mol/L醋酸鈉緩沖液，20 mmol/L FeCl3溶液，10 mmol/L TPTZ溶液以10∶1∶1體積比混合得到TPTZ工作液。稱量5.0 mg樣品置于10 mL離心管中，平行3次，加入2 mL TPTZ工作液于37 ℃反應30 min后，在592 nm處測定吸光度，以OD值表示還原能力。

1.5 抗菌分析

采用抑菌圈法考察包埋有肉桂醛的納米纖維膜的抑菌特性。選用革蘭氏陰性菌Escherichiacoli和革蘭氏陽性菌Staphylococcusaureus作為研究對象。用打孔器將纖維膜制成直徑5 mm的圓片在紫外燈下滅菌30 min。取100 μL菌懸液(1×106CFU/mL)均勻涂布于已滅菌的培養(yǎng)基上，然后將纖維膜貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.6 數(shù)據(jù)分析

以上所有納米纖維測試數(shù)據(jù)均至少進行3次平行試驗，以平均值±標準差表示。利用Origin軟件進行單因素方差分析和Tukey檢驗顯著性分析(P<0.05)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維形態(tài)及產(chǎn)率

圖1為添加不同濃度肉桂醛的明膠/玉米醇溶蛋白納米纖維的掃描電鏡圖的直徑分布圖。

圖1 負載不同濃度肉桂醛的明膠/玉米醇溶蛋白納米纖維電鏡圖的直徑分布圖Fig.1 SEM images and fiber diameter distributions of the gelatin/zein nanofibers with different concentration cinnamaldehyde

納米纖維微觀形貌穩(wěn)定，光滑均勻。肉桂醛濃度的變化對纖維直徑變化無顯著性影響。纖維直徑的變化受到多種因素的影響。LIU等[10]研究溶液吹紡法制備魚皮明膠基肉桂醛納米纖維，肉桂醛質(zhì)量分數(shù)從0%增加到30%，相應纖維直徑從67.5 nm增加到98.3 nm，歸因于在氣體輔助靜電紡絲過程中，聚合物溶液的黏度和表面張力變化對纖維形成的影響。WANG等[11]發(fā)現(xiàn)百里香酚能夠降低電紡液表面電荷密度，從而降低延伸率使纖維合并增加直徑。RIEGER等[12]研究殼聚糖/聚環(huán)氧乙烷負載肉桂醛(0%，0.5%，5.0%)，所得纖維直徑無顯著變化。如表1所示，參考DUAN等[13]的方法計算電紡產(chǎn)率。

表1 傳統(tǒng)電紡與氣流輔助電紡總流量與產(chǎn)率對比Table 1 Comparison of total flow and yield between conventional electrospinning and air-assisted electrospinning

傳統(tǒng)電紡總流量不超過2.0 mL/h，產(chǎn)率不超過1.0 g/h，而本研究中氣流輔助靜電紡絲技術總流量能達到10.0 mL/h，產(chǎn)率達到3.0 g/h。產(chǎn)率的提高強烈依賴于聚合物離開噴頭后，開放式高速氣流通常會引起被拉伸纖維的力學波動，破壞力學平衡，造成纖維多次分裂，同時溶劑加速揮發(fā)，充分沉積在收集器上。

2.2 紅外光譜

圖2 負載不同濃度肉桂醛納米纖維紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of the nanofibers with different concentration cinnamaldehyde

2.3 熱力學分析

圖3-a為添加不同濃度肉桂醛納米纖維的DSC譜圖，DSC曲線的特征吸熱峰稱為玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)和熔融溫度(Tm)。第1個峰(Peak1)表明聚合物從玻璃態(tài)變?yōu)楦邚棏B(tài)。隨著肉桂醛濃度的提高，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度從49.3 ℃升至62.2 ℃，玻璃化轉(zhuǎn)變反映了分子的流動性和可混合性，氫鍵相互作用能提高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度[18]。第2個峰(Peak2)代表熔融溫度(Tm)，一般來說較高的熔融點表明體系內(nèi)分子的相互作用較強，需要更高的能量使其解聚。在300～320 ℃的第3個峰(Peak3)歸因于納米纖維薄膜的熱降解。圖3-b為納米纖維熱重譜圖。生物聚合物的熱降解包括聚合物單體的內(nèi)部共價鍵和纖維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的降解，納米纖維的降解主要分2個階段，第1階段在40～120 ℃，主要是游離水、乙酸的揮發(fā)，這一區(qū)域的失重率均低于C0，可能是因為部分水與肉桂醛發(fā)生氫鍵的相互作用；第2階段在160～380 ℃，主要是明膠、玉米醇溶蛋白以及肉桂醛的降解。負載肉桂醛的納米纖維失重率顯著高于C0，失重溫度低于C0，表明肉桂醛的穩(wěn)定性較明膠、玉米醇溶蛋白差，而失重點均高于肉桂醛的揮發(fā)點248 ℃，說明納米纖維對肉桂醛的熱穩(wěn)定性有積極作用。

a-DSC;b-TGA圖3 負載不同濃度肉桂醛的明膠/玉米醇溶蛋白納米纖維熱力學分析圖Fig.3 Thermodynamic analysis diagram of the gelatin/zein nanofibers with different concentration cinnamaldehyde

2.4 水蒸氣透過率和機械性能分析

水蒸氣透過率是指示納米纖維水蒸氣阻隔性的關鍵參數(shù)。負載不同濃度肉桂醛的納米纖維的水蒸氣透過率如表2所示，由于肉桂醛的疏水性，質(zhì)量分數(shù)增加至0.1%時，水蒸氣阻隔性增強，然而肉桂醛質(zhì)量分數(shù)繼續(xù)增加到0.5%時，水蒸氣阻隔性相比對照有一定降低，當質(zhì)量分數(shù)達到1.0%時，水蒸氣透過率又出現(xiàn)降低趨勢。水蒸氣透過率的降低主要是受到肉桂醛的疏水性以及聚合物之間親疏水基團相互作用的影響。LIU等[24]將葵花籽油皮克林乳液添加到魔芋葡甘聚糖納米纖維能降低水蒸氣透過率，可能是由于分散的皮克林乳液擾亂基質(zhì)中水分子的遷移路徑，同時魔芋葡甘聚糖與乳液之間的氫鍵阻礙魔芋葡甘聚糖與水之間的相互作用。

表2 負載不同濃度肉桂醛的明膠/玉米醇溶蛋白納米纖維水蒸氣透過率和楊氏模量，拉伸強度，斷裂伸長率Table 2 WVP, young modulus, tensile strength, elongation at break results of the gelatin/zein nanofibers with different concentration cinnamaldehyde

納米纖維膜拉伸測試分析得到的楊氏模量、拉伸強度和斷裂伸長率見表2。楊氏模量指示納米纖維剛性結(jié)構(gòu)；拉伸強度指示納米纖維在斷裂前有效橫截面所能保持的最大拉力；斷裂伸長率指示納米纖維的延展性。本文添加肉桂醛后，楊氏模量與拉伸強度無顯著性變化，而C1.0斷裂伸長率顯著增強，說明納米纖維的延伸得到提高，通過增加分子鏈遷移而降低纖維的硬度，并提高彈性以及與聚合物基質(zhì)之間通過氫鍵進行的界面相互作用[11]。

2.5 抗氧化和抑菌分析

如圖4-a和4-b所示，隨著肉桂醛的加入，自由基清除率無顯著性變化，而鐵離子還原能力逐步提高，表現(xiàn)出量效關系。不同濃度肉桂醛納米纖維DPPH自由基清除率均在20%左右，主要歸因于肉桂醛結(jié)構(gòu)供氫能力弱，而明膠中存在抗氧化肽，玉米醇溶蛋白中固有的氨基酸殘基、短肽以及葉黃素的抗氧化能力[25]。C1.0鐵離子還原能力顯著高于其他負載濃度納米纖維，由于醛基的還原性，同時明膠/玉米醇溶蛋白對肉桂醛的負載提高溶解性，從而整體上提高離子還原能力。圖4-c為添加不同濃度肉桂醛納米纖維對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性分析。未添加肉桂醛的明膠/玉米醇溶蛋白納米纖維無顯著抑菌效果，與WANG等[11]實驗結(jié)果一致。肉桂醛的添加對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有顯著抑制作用，肉桂醛已被研究證明對多種食源性病原體具有顯著的抗菌活性，其作用機制主要是疏水結(jié)構(gòu)和游離醛基可以改變膜的物理化學性質(zhì)，影響雙層膜的穩(wěn)定性和脂質(zhì)有序性，膜通透性平衡被打破，導致細胞功能障礙和細胞內(nèi)成分滲出，最終導致細菌死亡[26]。

a-DPPH;b-FRAP;c-抑菌圈結(jié)果圖4 負載不同濃度肉桂醛的明膠/玉米醇溶蛋白納米纖維抗氧化與抑菌圈分析結(jié)果Fig.4 Antioxidant activity and antimicrobial effect of the gelatin/zein nanofibers with different concentration cinnamaldehyde

3 結(jié)論

本文采用氣流輔助靜電紡絲技術成功制備添加不同濃度肉桂醛/明膠/玉米醇溶蛋白納米纖維。氣流輔助加速纖維的拉伸分裂提高產(chǎn)率，同時纖維形貌光滑均勻，無斷裂聚集。結(jié)構(gòu)分析證實，肉桂醛均勻分散在納米纖維中，肉桂醛、明膠和玉米醇溶蛋白之間的相互作用發(fā)生在分子水平上，主要是氫鍵的作用。肉桂醛的疏水、塑化等特性改善納米纖維的水蒸氣阻隔性與機械強度。通過該技術負載肉桂醛，提升其熱穩(wěn)定性并保留抗氧化、抗菌等生物活性。綜上所述，明膠/玉米醇溶蛋白納米纖維負載肉桂醛具有開發(fā)為可食用食品活性包裝的前景。