楊子新 王勝蘭

AAT是一種蛋白酶抑制劑，主要在肝細(xì)胞中表達(dá)，然后通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌到血液中，以保護(hù)肺免受中性粒細(xì)胞蛋白水解酶的降解，由位于14號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的 SERPINA1基因編碼，Pi*M是正常的等位基因，但據(jù)報(bào)道，該位點(diǎn)上已經(jīng)發(fā)生了超過(guò)150個(gè)突變，最常見(jiàn)的是Pi*Z型和Pi*S型[1]。Z型突變是342位谷氨酸被賴氨酸取代，S型突變是264位的谷氨酸被纈氨酸取代，還有一些罕見(jiàn)病變，如Mmalton型等。Z型產(chǎn)生的AAT是正常水平的10%～20%，S型產(chǎn)生的AAT是正常水平的60%～80%[2]。ZZ純合子是臨床上導(dǎo)致AATD最常見(jiàn)的基因型，約96%的相關(guān)疾病與此相關(guān)，血清AAT水平極低，僅達(dá)正常的10%～15%，另外少部分是SS、SZ、MZ等，血清AAT水平僅為正常值的35%～70%[3]。由于SERPINA1基因突變導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)生成的AAT異常聚集，異常聚集的AAT多聚體(Z-ATT)不能通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌到循環(huán)血液中，滯留在肝細(xì)胞內(nèi)，造成蛋白毒性肝損傷，引起成人及兒童肝病。

一、遺傳流行病學(xué)特性

典型的重癥AATD多由Pi*Z純合子變異引起，在歐洲人中的比例大約是1：2000，其特點(diǎn)是血清AAT濃度顯著降低(低85%左右)，蛋白酶與蛋白酶抑制劑之間嚴(yán)重失衡；雜合型Pi*MZ可在1/30高加索人中發(fā)現(xiàn)，AAT血清濃度基本正?；蛘咻p微降低；復(fù)合雜合型Pi*SZ是由反式Pi*Z和Pi*S變異體同時(shí)存在所致，它在高加索人中占到的比例大約為1/500，表現(xiàn)出中等的AAT血清濃度；Pi*SS基因型(即純合子Pi*S等位基因)與Pi*SZ大致相同，但似乎不構(gòu)成發(fā)生肝病的臨床相關(guān)危險(xiǎn)因素[4]。

二、AATD相關(guān)肝病的發(fā)病機(jī)制

嚴(yán)重的AATD病例多由Pi*Z純合子引起，Z-AAT蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)積聚引起相關(guān)肝病，但是其發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚。

(一)Z-AAT引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷 Z-AAT通過(guò)改變各種細(xì)胞器的關(guān)鍵功能在AATD相關(guān)肝病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、蛋白酶體降解系統(tǒng)和線粒體等[5]。線粒體，細(xì)胞內(nèi)的雙膜結(jié)構(gòu)，是發(fā)生呼吸和能量產(chǎn)生的高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器。由于肝臟在碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)代謝動(dòng)態(tài)平衡中的中心作用，肝細(xì)胞含有高密度的線粒體。Z-AAT引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，然而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激又與脂滴的形成有關(guān)。在許多蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊疾病中，脂滴的積累被觀察到是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的普遍下游效應(yīng)[6]。脂滴是一種細(xì)胞器，作為動(dòng)物細(xì)胞中脂類的儲(chǔ)存室，也與線粒體相關(guān)。值得注意的是，脂滴已被證明通過(guò)確保最大限度的氧化代謝和動(dòng)態(tài)平衡來(lái)調(diào)節(jié)線粒體的動(dòng)態(tài)。線粒體在脂滴表面蛋白Perilipin 5 (Plin5) 的介導(dǎo)下重新聚集到脂滴表面，改變線粒體的生物性能[7]。脂滴作為與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的細(xì)胞器，通過(guò)重新平衡內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脂類平衡，去除錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)自噬，對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的破壞做出反應(yīng)，起到保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增強(qiáng)了脂滴的形成和積累，脂滴產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)大量招募其周圍的線粒體，負(fù)責(zé)為需要ATP的脂質(zhì)合成和循環(huán)過(guò)程提供ATP，線粒體耗氧量和ATP產(chǎn)生增加，導(dǎo)致線粒體氧化和還原壓力增大，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷甚至死亡[8]。

(二)Z-AAT使肝臟中的線粒體發(fā)生自噬 既往在Pi*Z小鼠模型的肝臟中自噬被結(jié)構(gòu)性地激活[9]。自噬是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白分解途徑，在應(yīng)激、發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)缺乏的時(shí)候，特殊的空泡從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上產(chǎn)生并吞噬降解的靶標(biāo)，可能構(gòu)成一種通過(guò)降解突變體Z-AAT來(lái)保護(hù)肝細(xì)胞的機(jī)制[10]。肝細(xì)胞內(nèi)自噬活性的顯著增加可能會(huì)導(dǎo)致自噬小體中的各種亞細(xì)胞結(jié)降解。早期自噬液泡中線粒體的超微結(jié)構(gòu)特征表現(xiàn)為在同一細(xì)胞的其他區(qū)域和在其他細(xì)胞中，線粒體完全被包裹在周邊的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)，有時(shí)具有完整的、正常的脊和正常的電子密度；有時(shí)線粒體隨著電子密度的增加而被壓縮，被兩個(gè)或多個(gè)光滑的膜包圍。晚期自噬液泡的特征表現(xiàn)為一些線粒體位于多層膜內(nèi)，整個(gè)液泡經(jīng)?；蛘邔?shí)際上與溶酶體融合，線粒體幾乎完全轉(zhuǎn)化為電子致密碎片[11]。LAMP1蛋白也是已知的標(biāo)記晚期自噬小體。Jeffrey等[9]用溶酶體膜蛋白LAMP1的抗體免疫標(biāo)記檢測(cè)了Pi*Z肝臟樣本。含有許多線粒體和豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，有容易識(shí)別的空泡，其中包含線粒體結(jié)構(gòu)，可辨認(rèn)出脊?fàn)钔黄穑张荼籐AMP1標(biāo)記為陽(yáng)性。在正常肝標(biāo)本中，線粒體周圍的LAMP1陽(yáng)性結(jié)構(gòu)很難被發(fā)現(xiàn)。綜上所述表明，線粒體自噬在Pi*Z肝臟中是一個(gè)頻繁和持續(xù)的過(guò)程[11]。

(三)Z-AAT激活JNK途徑上調(diào)SERPINA1的轉(zhuǎn)錄，加劇Z-AAT的積聚 c-Jun是JNK通過(guò)磷酸化激活的主要細(xì)胞底物之一，通過(guò)Pi*Z小鼠肝臟中磷酸化c-Jun水平的增加,證實(shí)了c-JUN的激活[12]。c-Jun通過(guò)結(jié)合和反式激活SERPINA1的AP-1位點(diǎn)，上調(diào)SERPINA1的表達(dá)。與對(duì)照組相比，Pi*ZZ患者的肝臟表現(xiàn)出更強(qiáng)的JNK活性，表明Z-AAT激活JNK途徑上調(diào)SERPINA1的轉(zhuǎn)錄，加劇Z-AAT的積聚，損害肝細(xì)胞[13]。

(四)Z-AAT及乙型肝炎表面抗原雙重蛋白毒性應(yīng)激 HBV S基因(HBs)產(chǎn)生三種表面(包膜)蛋白，即小表面蛋白(S)、中間表面蛋白(前S2和S)和大表面蛋白(前S1、前S2和S)。由乙型肝炎表面基因突變引起的大表面蛋白的過(guò)度形成限制在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的膜狀顆粒的形成，導(dǎo)致其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累，形成毛玻璃樣肝細(xì)胞。盡管Z-AAT和HBs表現(xiàn)出不同的溶解性質(zhì)和不同的分布模式，但HBs-PIZ動(dòng)物均表現(xiàn)出Z-AAT/HBs在降解途徑中的保留和自噬適配器p62的顯著積累[14]。同時(shí)對(duì)含有p62的顆粒的分離顯示保留了HBs/Z-AAT。P62的積聚又導(dǎo)致p62-Nrf2軸的激活和活性氧物種的出現(xiàn)。所以當(dāng)兩種主要的蛋白毒性應(yīng)激同時(shí)存在時(shí)，通過(guò)蛋白滯留和p62-Nrf2軸的激活促進(jìn)了肝損傷的發(fā)展[15]。

(五) NSAIDs藥物的作用 AATD的動(dòng)物模型研究表明，NSAIDs藥物可導(dǎo)致Pi*Z小鼠肝臟損傷加重，表現(xiàn)為肝細(xì)胞增殖增加和caspase 9活性增強(qiáng)[16]。NSAIDs藥物又可激活Pi*Z小鼠體內(nèi)IL-6-STAT3細(xì)胞因子信號(hào)通路。前列腺素可負(fù)向調(diào)節(jié)TNF-IL-6-STAT3信號(hào)通路，而NSAIDs抑制前列腺素合成，故可增強(qiáng)該信號(hào)通路，由于該信號(hào)通路可誘導(dǎo)肝臟中包括AAT在內(nèi)的急性期時(shí)相反應(yīng)物的表達(dá)，增加AAT的合成，從而增加錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積累，進(jìn)一步加重肝損傷[16-17]。

三、AATD肝病的臨床表現(xiàn)

(一)AATD中的成人肝病 AATD在成人中的發(fā)病年齡主要在50歲左右，帶Z和M(malton)等位基因的成人可能出現(xiàn)慢性肝炎、肝硬化或肝細(xì)胞癌，攜帶Pi*ZZ基因的成人中約40%存在有組織學(xué)意義的肝損傷和肝硬化[18]。目前認(rèn)為，男性、年齡>50歲，代謝綜合征和肥胖是重度AATD成人患者進(jìn)展為晚期肝臟疾病的危險(xiǎn)因素。ATTD和飲酒的相關(guān)性尚不清楚，但酒精濫用似乎會(huì)加速AATD相關(guān)肝纖維化的進(jìn)展[16]。

(二)AATD中的兒童肝病 AATD會(huì)導(dǎo)致兒童肝臟損傷，最常見(jiàn)的表現(xiàn)是新生兒肝炎綜合征，包括膽汁淤積性黃疸、喂養(yǎng)困難、肝脾大、生長(zhǎng)困難、胃腸道出血等。然而多項(xiàng)研究表明，大多數(shù)Pi*ZZ兒童是健康的，在兒童時(shí)期并沒(méi)有被診斷出來(lái)；少數(shù)Pi*ZZ兒童發(fā)展為膽汁淤積性肝炎(新生兒肝炎綜合征)，主要表現(xiàn)為血清結(jié)合膽紅素、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高；大多數(shù)患有膽汁淤積性肝炎的新生兒可自發(fā)改善,但是仍有一部分Pi*ZZ新生兒表現(xiàn)出嚴(yán)重肝病并發(fā)癥，如肝硬化、門靜脈高壓和肝功能衰竭[17]。

四、AATD的診斷

迄今為止，臨床醫(yī)生對(duì)AATD的認(rèn)識(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，診斷可能延遲5～10年。研究表明，80%～90%的AATD患者由于缺乏臨床癥狀，或被誤診為酒精性肝病或非酒精性脂肪性肝病等其他肝硬化病因[19]。對(duì)于有肝臟疾病家族史、不明原因慢性肝病病史或臨床表現(xiàn)等患者應(yīng)該行AATD檢測(cè)。

(一)血清AAT水平的測(cè)定 血清AAT水平可通過(guò)比濁法測(cè)定，有時(shí)也可使用乳膠增強(qiáng)免疫比濁法；目前已不再推薦使用放射免疫擴(kuò)散法和火箭免疫電泳法。人群研究表明，血清AAT的最低閾值為11μmol/L(約57 mg/dL)，低于該值則AAT含量不足。但AAT是急性期反應(yīng)物，發(fā)生炎癥時(shí)，真實(shí)的血清AAT水平可能會(huì)被高估，因此應(yīng)該避免在患者炎癥期間測(cè)定血清AAT水平[20]。

(二)等電聚焦技術(shù) 對(duì)定量檢測(cè)AAT水平異常的患者，可進(jìn)行表型檢測(cè),根據(jù)各種突變，根據(jù)各種突變蛋白的等電點(diǎn)不同,用等電聚焦法檢測(cè)。根據(jù)各種突變蛋白在pH梯度下的電泳遷移率不同，將它們分成不同的類型:F、S、M、Z[21]。此外，當(dāng)患者體內(nèi)AAT含量比較低以及無(wú)效突變血中沒(méi)有AAT時(shí)，其表型可能不能被測(cè)定出來(lái) 尚需進(jìn)一步借助基因測(cè)序。

(三)基因測(cè)序 AAT的基因分型通常從全血或干血斑中提取出DNA，采用PCR進(jìn)行基因擴(kuò)增，然后對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序。等位基因特異性基因分型試驗(yàn)用于檢測(cè)更普遍的Pi*S和Pi*Z，以及罕見(jiàn)的變異Pi*Malton。當(dāng)?shù)任换蛱禺愋曰蚍中头治霾荒芴峁〢AT等位基因的完整鑒定時(shí)，需對(duì)SERPINA1編碼區(qū)進(jìn)行直接測(cè)序[22]。

(四)肝活檢 肝活檢是評(píng)估肝臟損傷和纖維化程度非常有用的工具。對(duì)于AATD相關(guān)肝病患者，肝活檢可能不是必需的檢查手段，但仍是明確診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。

五、AATD相關(guān)肝病的治療

目前尚無(wú)針對(duì)AATD相關(guān)肝病的治療藥物，肝移植是解決晚期肝硬化的唯一途徑。隨著對(duì)AATD肝病的認(rèn)識(shí)不斷加深，多種針對(duì)性的治療方案成為研究的熱點(diǎn)。

(一)一般治療 目前針對(duì)AATD引起的肝病無(wú)特異性方法，進(jìn)行性肝損傷的治療主要以支持為主，包括注意營(yíng)養(yǎng)，預(yù)防軟骨病，以及凝血障礙的早期識(shí)別和治療。臨床醫(yī)生應(yīng)治療門靜脈高壓并處理并發(fā)癥，如門脈高壓性胃病、食管胃底靜脈曲張出血和腹水等。

(二)肝移植 對(duì)于終末期肝病患者，肝移植是唯一有效的治療手段。在成人患者中，肝臟病變通常發(fā)展到明顯的肝硬化或者肝細(xì)胞癌時(shí)才被發(fā)現(xiàn)，肝移植可以獲得較好的治療效果；在兒童患者中，一部分出現(xiàn)長(zhǎng)期黃疸，但是未見(jiàn)進(jìn)一步的并發(fā)癥，一部分出現(xiàn)明顯肝硬化需要進(jìn)行肝移植治療。AATD肝病患者肝臟可能很快發(fā)生失代償，因此應(yīng)該早期對(duì)AATD高?；颊咝懈喂δ艿娜嬖u(píng)估，已期盡早干預(yù)，獲得較好的治療效果[23]。

(三)未來(lái)治療新方向 針對(duì)AATD的現(xiàn)行治療方法多為靜脈注射純化人血漿來(lái)源的AAT，但肝臟疾病是由錯(cuò)誤折疊的Z-AAT在胞內(nèi)異常堆積所致，因此AATD相關(guān)肝病無(wú)明顯療效，只有抑制缺陷型Z-AAT的表達(dá)才能緩解或治療AATD相關(guān)肝病。其他的新方案包括：

1.小干擾RNA：小干擾RNA(siRNA)是一個(gè)長(zhǎng)20～25個(gè)核苷酸的雙股RNA，主要參與RNA干擾現(xiàn)象。siRNA與N-乙酰半乳糖胺殘基偶聯(lián)，通過(guò)去唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)肝細(xì)胞特異性攝取[4]。siRNA片段加載到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體中，靶向mRNA被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶降解，引發(fā)靶向mRNA降解，抑制突變蛋白的產(chǎn)生，使血清和肝臟Z-AAT水平顯著降低，從而減輕蛋白肝毒性[24]。

2.化學(xué)伴侶：化學(xué)伴侶是一類協(xié)助新生肽鏈正確折疊的蛋白質(zhì)，可以穩(wěn)定天然AAT，并改善蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊，如4-苯基丁酸及氧化三甲胺等。但既往人體試驗(yàn)表明，人體安全水平的化學(xué)伴侶達(dá)不到小鼠模型中的藥物濃度，肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的化學(xué)伴侶藥物濃度不足，因此無(wú)法有效地發(fā)揮作用[25]。

3.自噬增強(qiáng)劑：其可誘導(dǎo)自噬，促進(jìn)異常蛋白質(zhì)的降解。Z-AAT可以激活NF-κB信號(hào)通路，參與自噬，增強(qiáng)劑如卡馬西平、西羅莫司、膽汁酸和熊去氧膽酸能加強(qiáng)該通路，但這些藥物尚處于臨床試驗(yàn)階段[26]。

4.合成肽：其具有防止Z-AAT在肝細(xì)胞內(nèi)積聚的潛力。與AAT反應(yīng)環(huán)P7-2序列相對(duì)應(yīng)的6肽被證明完全抑制Z-AAT的聚合，而對(duì)正常形式的AAT沒(méi)有任何抑制作用[27]。 因此，該分子具有防止Z-AAT在肝細(xì)胞內(nèi)積聚的潛力，從而治療AAT相關(guān)肝病。

5.單克隆抗體：可以防止Z-AAT在細(xì)胞內(nèi)聚合，增加肝臟分泌正常的AAT。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了單抗檢測(cè)AAT的突變構(gòu)象，如體內(nèi)的scFv4B12是4B12單抗的單鏈可變片段，可以防止Pi*ZZ小鼠細(xì)胞內(nèi)異常AAT的聚合，并增加其肝臟分泌，同時(shí)保留中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制功能，但是這種結(jié)果僅在體外證實(shí)過(guò)[28]。

6.基因修復(fù)技術(shù)：基因修復(fù)技術(shù)如CRISPR-Cas9正在改變?cè)S多醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，如人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒感染，以及單基因疾病等[25]。Bjursell等[29]證實(shí)，Pi*ZZ小鼠通過(guò)CRISPR成功地進(jìn)行基因編輯后，可以減少突變的Z蛋白聚集以及增加正常AAT的適度表達(dá)。

綜上，對(duì)于沒(méi)有任何明確病因的慢性肝病患者，應(yīng)進(jìn)AATD檢測(cè)。目前還沒(méi)有針對(duì)AATD相關(guān)肝病的特異性藥物治療方案，因此迫切需要探索和研發(fā)有效的藥物，以減少肝移植的需要和減緩疾病的進(jìn)展。基因治療和siRNA等新技術(shù)為治療AATD所致肝病帶來(lái)了希望，但目前多處于探索階段，仍需要進(jìn)一步的研究。