淮國(guó)麗， 杜嘉祥， 潘登科

1 電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院， 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院， 臨床免疫轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 610072；2 成都中科奧格生物科技有限公司， 成都 610094

對(duì)于肝細(xì)胞癌或急性肝病等終末期肝病患者，肝移植是唯一的治療方式，但是供體的極度短缺嚴(yán)重影響了等待移植者生命的延續(xù)。近五年來(lái)，我國(guó)器官捐獻(xiàn)率有所上升，但是供肝和移植需求的比例仍嚴(yán)重失衡。2020年，我國(guó)共有17 897例患者接受移植，但是僅占等待移植患者的5%左右，這意味著有近95%的患者可能因?yàn)榈却陂g病情惡化等因素錯(cuò)過(guò)移植機(jī)會(huì)或者被移出等待名單[1-2]。利用豬來(lái)源的供體肝和肝細(xì)胞被認(rèn)為是潛在的解決器官緊缺問題的有效方案。1968年，Calne 等[3]首次嘗試野生型豬-非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的異種肝移植實(shí)驗(yàn)，術(shù)后6～30 h內(nèi)，7只狒狒中有4只死于大量出血，考慮其主要的死亡原因是超急性排斥反應(yīng)(hyperacute rejection，HAR)。α-1,3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶(α-1,3-galactosy transferase，GGTA1)的敲除(GTKO)使HAR問題基本被解決，但是移植物仍無(wú)法長(zhǎng)期存活[4]。目前，研究者認(rèn)為影響異種肝移植存活率的主要原因包括：移植物血栓性微血管病(thrombotic microangiopathy，TMA)，持續(xù)性血小板減少癥和全身性消耗性凝血功能障礙，且伴隨的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫排斥反應(yīng)影響細(xì)胞肝移植物的長(zhǎng)期生存[5]。此外，由于肝臟是一個(gè)具備合成功能的特殊器官，供體與受體的不相容性也會(huì)影響移植物的存活，因此，探索適用于異種肝移植的人源化肝臟也是解決異種肝移植問題的一個(gè)思路。根據(jù)影響異種肝移植術(shù)后影響移植物存活的因素，本文將從基因編輯豬和嵌合體2個(gè)角度進(jìn)行綜述，并展望基因編輯豬和嵌合體豬在未來(lái)異種肝移植的臨床應(yīng)用。

1 應(yīng)對(duì)固有免疫的基因改造

1.1 HAR 從1968年Calne 等實(shí)施第1例野生型(WT)豬到非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的異種肝移植后的20年內(nèi)，一些研究團(tuán)隊(duì)完成了幾十例WT豬到非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的異種肝移植實(shí)驗(yàn)。然而，受體的存活時(shí)間從未超過(guò)3 d，移植后均發(fā)生HAR，并且發(fā)現(xiàn)受體內(nèi)出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及IgM、IgG和C3的沉積，受體的血管有血栓形成和出血性壞死等現(xiàn)象，由此推斷野生型豬作為供體很可能會(huì)造成移植失敗[3,6-8]。在2000年，Ramirez等[9]實(shí)施了第1例以表達(dá)衰減加速因子(CD55)的轉(zhuǎn)基因豬為供體，對(duì)狒狒進(jìn)行原位異種肝移植，狒狒存活8 d并且肝移植物未表現(xiàn)出HAR的病理學(xué)特征，提示CD55可顯著限制補(bǔ)體活化并有效控制HAR強(qiáng)度。2005年，該團(tuán)隊(duì)在供體豬內(nèi)又轉(zhuǎn)入人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白-MAC抑制蛋白(CD59)和α-1,2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(H-transferase)，將CD55/CD59/H-transferase供體肝移植至狒狒體內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)供肝未出現(xiàn)明顯的HAR且肝臟結(jié)構(gòu)完整，但存活時(shí)間僅延長(zhǎng)了13～24 h。以上基因編輯豬雖然對(duì)HAR有所改善，但并未實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間[10]。隨后，大量研究發(fā)現(xiàn)供體豬的特異性抗原包括α-Gal才是導(dǎo)致HAR的主要因素。2010年，Esker等[11]首次使用α-Gal敲除(GTKO)且表達(dá)人膜輔因子蛋白(CD46)的小型豬作為供體開展異種肝移植，受體術(shù)后雖然出現(xiàn)了嚴(yán)重的血小板減少癥，但肝功能正常，且生存時(shí)間延長(zhǎng)至7 d。

以上敲除GGTA1可有效改善HAR的發(fā)生，移植物的生存時(shí)間仍未明顯改善，有研究團(tuán)隊(duì)嘗試獲得包括α-Gal抗原以內(nèi)的抗原雙敲或者三敲豬來(lái)作為供體來(lái)改善豬和人的不相容性。Butler等[12]通過(guò)體外檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胞苷單磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶(CMAH)聯(lián)合GGTA1敲除即GGTA1-/-CMAH-/-豬肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)比GGTA1-/-與人血小板結(jié)合更少，提示抗原雙敲除比單敲除更能抑制體液免疫反應(yīng)。此外， Cimeno等[13]利用體外灌注模型研究發(fā)現(xiàn)基因型為GTKO/hCD46/Neu5GcKO的豬肝，相較于GTKO/hCD46基因型而言，白蛋白表達(dá)水平更高，提示Neu5GcKO表型可降低抗原特異性，對(duì)移植物具有保護(hù)作用。盡管如此，有學(xué)者[14]認(rèn)為GTKO和CMAHKO 雙敲豬仍不足以實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)移植物的存活率。此后，Li等[15]利用CRISPE/CAS9技術(shù)敲除了永生化豬內(nèi)皮細(xì)胞中4個(gè)主要異種抗原GTKO、CMAH、β-1,4-N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶(B4GALNT)和SLA-Ⅰ，在體外觀察人對(duì)抗原敲除豬的特異性反應(yīng)，結(jié)果顯示，這4個(gè)抗原的敲除可以顯著降低豬細(xì)胞的抗原性，但是仍能激活人的自然殺傷細(xì)胞反應(yīng)。

綜上所述，通過(guò)基因編輯技術(shù)對(duì)供體豬GGTA1、CMAH、β4galNT2和SLA-Ⅰ進(jìn)行抗原雙敲除乃至多敲除可以降低異種肝移植的異種特異性反應(yīng)，但若聯(lián)合人體調(diào)節(jié)補(bǔ)體蛋白的轉(zhuǎn)入包括CD46，CD55和CD59，異種肝移植術(shù)后排斥反應(yīng)等引起的肝移植物損失可能會(huì)大有改善。但異種肝移植后的血小板減少癥等問題還需要通過(guò)其他相關(guān)基因的編輯來(lái)緩解，由此才能更進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)移植物生存時(shí)間的期望。

1.2 血小板減少癥 目前，豬到非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的異種肝移植試驗(yàn)結(jié)果表明，異種肝移植術(shù)后的受體會(huì)很快出現(xiàn)移植物TMA，持續(xù)性血小板減少癥和全身性耗竭性凝血功能障礙，而這些問題也是影響異種肝移植存活時(shí)間的主要原因。所以，針對(duì)固有免疫細(xì)胞介導(dǎo)的血小板吞噬作用以及凝血相關(guān)蛋白激活的凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)等問題，可以利用基因編輯技術(shù)對(duì)供體豬進(jìn)行改造，來(lái)改善異種肝移植術(shù)后移植物丟失問題[1]。

在豬-非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的異種肝移植中，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物血小板會(huì)被豬肝移植物識(shí)別為“外來(lái)物”，并被豬 Kupffer細(xì)胞和LSEC吞噬[16]。CD47是一種在所有組織中普遍表達(dá)的Ig超家族的整合素相關(guān)蛋白，其與巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表達(dá)的信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α結(jié)合，將Src同源區(qū)2蛋白酪氨酸磷酸酶1募集到磷酸化的免疫受體酪氨酸相關(guān)的抑制性基序，印上能夠調(diào)節(jié)自我吞噬的抑制信號(hào)(“不要吃我信號(hào)”)，該信號(hào)可減少巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的調(diào)理細(xì)胞吞噬作用[17]。潘登科團(tuán)隊(duì)[18]成功制備GTKO/hCD47巴馬小型豬，并驗(yàn)證了hCD47的轉(zhuǎn)入可以減弱異種移植中由受體巨噬細(xì)胞引起的排斥反應(yīng)。Zhang等[19]將GTKO/hCD7豬的肝臟移植到藏酋猴中，發(fā)現(xiàn)異位輔助移植后受者血流量穩(wěn)定，受體沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的凝血障礙或免疫排斥反應(yīng)。由此可知，將人CD47在豬內(nèi)皮細(xì)胞上的異位表達(dá)可以顯著減少人類巨噬細(xì)胞對(duì)異種細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用。此外，Paris等[20]發(fā)現(xiàn)異種肝移植在數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)后會(huì)發(fā)生血小板減少癥，主要是由于豬LSEC識(shí)別并結(jié)合半乳糖b1-4N-乙?；咸烟前?Galb1,4-NacGlc)糖蛋白通過(guò)去唾液酸糖蛋白受體1(recombinant asialoglycoprotein receptor 1，ASGR1)介導(dǎo)發(fā)生結(jié)合和吞噬血小板，通過(guò)去唾液酸糖蛋白處理消除這種糖蛋白可降低血小板的吞噬作用。2015年，該團(tuán)隊(duì)使用TALEN技術(shù)敲除供體豬的ASGR1基因，結(jié)果顯示ASGR1-/-豬肝臟在灌注期間吞噬的人血小板數(shù)少于家豬肝臟，說(shuō)明供體豬ASGRI基因敲除可減少豬-人異種移植中血小板的吞噬，這對(duì)于異種肝移植中移植物的存活至關(guān)重要[21]。2016年，潘登科團(tuán)隊(duì)[22]成功制備出GTKO/ASGR1KO五指山小型豬，為解決異種肝移植后的血小板減少癥這一問題提供了良好的基礎(chǔ)材料。

除了排除固有免疫細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用，還可以改造與凝血功能有關(guān)的基因位點(diǎn)來(lái)改善異種肝移植后的凝血功能障礙等問題。組織因子(tissue factor，TF)是異種肝移植誘導(dǎo)的耗竭性凝血病的主要驅(qū)動(dòng)因素，而TF途徑抑制因子(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)可抑制TF活性。Ahrens等[23]研究證實(shí)，與WT豬相比，TF的siRNA敲低豬的凝血時(shí)間顯著增加，血栓形成減少。據(jù)報(bào)道[24]，竇科峰院士團(tuán)隊(duì)指出表達(dá)人TFPI的豬在臨床前試驗(yàn)中已經(jīng)出現(xiàn)了令人期待的結(jié)果。Pen等[25]體外檢測(cè)了原代細(xì)胞對(duì)狒狒或豬血小板的聚集能力，發(fā)現(xiàn)豬LSEC對(duì)狒狒小板的吞噬作用最為明顯，通過(guò)阻斷vWF和整合素黏附途徑可以阻止血發(fā)現(xiàn)小板聚集和吞噬作用。除此之外，向豬體內(nèi)轉(zhuǎn)入人血栓調(diào)節(jié)蛋白(human thrombomodulin，hTM)細(xì)胞可以在體外顯著增強(qiáng)人活化蛋白C的表達(dá)[25]，但是來(lái)自hTM轉(zhuǎn)基因豬的器官在肝臟中的表達(dá)最低，需要進(jìn)一步優(yōu)化豬肝臟中的hTM表達(dá)來(lái)評(píng)估這個(gè)基因改造對(duì)肝異種移植的作用[26]。此外，多項(xiàng)研究表明還可以通過(guò)表達(dá)人類抗血栓或抗凝基因例如CD39[27]、內(nèi)皮蛋白C受體(hEPCR)[28]來(lái)減輕凝血級(jí)聯(lián)激活引起的凝血功能障礙，提高異種移植的存活率。

通過(guò)對(duì)供體豬進(jìn)行特定分子的改造可以減輕異種肝移植術(shù)后面臨的急性排斥反應(yīng)以及血小板減少癥和TMA等凝血功能障礙等問題。為了改善豬移植物和人類免疫系統(tǒng)之間的免疫和生理分子不相容性，延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間，可以通過(guò)單獨(dú)或聯(lián)合多種豬特異性抗原表位敲除、敲入人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白和凝血調(diào)節(jié)相關(guān)因子蛋白來(lái)開發(fā)基因工程豬[29]。2020年，竇科峰院士團(tuán)隊(duì)開展了13基因改良豬到恒河猴的異種肝移植試驗(yàn)，供體豬基因型為PERV-KO/GalT-KO/b4GalNT2-KO/CMAH-KO/hCD46/hCD55/hCD59/hb2M/hHLA-E/hCD47/hTHBD/hTFPI/hCD39(PERV-KO/3-KO/9-TG)，移植物術(shù)后存活26 d，該研究驗(yàn)證了13基因豬可以抑制異種移植排斥和受體凝血異常，但此9基因的摻入并未完全避免異位輔助肝移植對(duì)異種移植物的損害[24]。此外，Cimeno等[13]通過(guò)體外灌注模型發(fā)現(xiàn) ，GalTKO/hCD46/Neu5GcKO比GTKO/hCD46/hCD55/hEPCR/hTFPI/hCD47的豬肝的白蛋白表達(dá)水平更高。上述研究提示，雖然選擇聯(lián)合多種基因組合可以改善移植物的存活，但是基因組合并不一定是越多越好。因此，篩選較優(yōu)的基因型組合非常重要。此外，Shah等[30]利用無(wú)pCMV的GTKO豬作為供體，并給予外源性人體凝血因子和共刺激阻滯劑調(diào)整抑制劑方案，術(shù)后受體未出現(xiàn)排斥、炎癥或TMA，且實(shí)現(xiàn)了移植物存活時(shí)間長(zhǎng)達(dá)29 d，這無(wú)疑為未來(lái)加速肝移植走向臨床應(yīng)用提供了一個(gè)有效的治療思路。

2 人源化肝臟嵌合體豬

免疫排斥是異種移植中現(xiàn)存的主要障礙，但這主要針對(duì)功能性單一的器官，如本身承載較少的代謝和分泌的心臟、腎臟等[31]。而對(duì)于具有復(fù)雜性功能的器官，如肝臟、肺臟等，為實(shí)現(xiàn)移植物的長(zhǎng)期存活，除了解決免疫排斥問題外還需對(duì)其他功能性基因進(jìn)行人源化改造。目前的基因工程技術(shù)雖已取得一些突破性進(jìn)展，但一次性定向改造所有基因仍是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)的研究工作。目前，在豬體內(nèi)培育人源化器官是一種較為可行的解決方案。

根據(jù)目前的研究，已經(jīng)可以制備物種相近的嵌合體動(dòng)物。2010年，美國(guó)和日本的研究團(tuán)隊(duì)[32-33]完成了大小鼠嵌合個(gè)體的制備，并成功在小鼠體內(nèi)培育出大鼠的胰腺。但目前可成功培育物種差異大的嵌合個(gè)體較少。2017年，美國(guó)研究團(tuán)隊(duì)[34]開展了豬人嵌合體胚胎實(shí)驗(yàn)，觀察時(shí)間為3～4周，結(jié)果表明人細(xì)胞占比約為1/100 000。2019年，我國(guó)研究團(tuán)隊(duì)[35]成功制備了2只豬猴嵌合體，新個(gè)體中嵌合的藏酋猴細(xì)胞比例為1/10 000～1/1000，雖然該比例仍很低，但這標(biāo)志著嵌合體研究的巨大進(jìn)步。即便異種嵌合體研究的目的是服務(wù)于人，且可以解決器官資源短缺問題，但仍會(huì)受到倫理道德的約束。例如在歐美部分國(guó)家，人體器官的嵌合體研究是被允許的，但在人與動(dòng)物的嵌合體中，人細(xì)胞不能進(jìn)入到動(dòng)物的生殖系統(tǒng)和大腦中[36]。為了避免以上問題，可通過(guò)影像學(xué)結(jié)合手術(shù)的方式，對(duì)胚胎期仔豬的肝臟部位定向注射人源干細(xì)胞，由于人源干細(xì)胞提前轉(zhuǎn)入了條件性自殺性基因，在進(jìn)入其他組織時(shí)人源干細(xì)胞將會(huì)啟動(dòng)自殺程序，可以防止在非肝臟部位形成嵌合體[37]。

目前，嵌合體發(fā)育遇到的主要障礙是不同物種細(xì)胞間不能很好地形成免疫耐受，這一問題可通過(guò)培育免疫缺陷動(dòng)物來(lái)提高嵌合比例。白介素受體亞基γ(interleukin 2 receptor subunit gamma，IL2RG)、重組激活基因(Recombination activating gene，Rag)1和Rag2是激活特異性免疫的關(guān)鍵基因，敲除后個(gè)體表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞缺失且缺乏補(bǔ)體活性，通過(guò)這種方式可以獲得一種重度免疫缺陷個(gè)體[38-39]。由于免疫缺陷動(dòng)物的培育還需要在無(wú)菌環(huán)境下結(jié)合剖腹產(chǎn)手術(shù)完成，特別是臨床級(jí)別的醫(yī)用供體豬制備，所以此手術(shù)需在無(wú)指定病原體(designated pathogen free，DPF)超潔凈級(jí)設(shè)施內(nèi)開展。此外，對(duì)肝臟先天性損傷的豬胚胎進(jìn)行人干細(xì)胞嵌合，能夠在豬體內(nèi)制備人源化肝臟。延胡索酸乙酰乙酸水解酶基因(fumarylacetoacetate hydrolase，F(xiàn)AH)的缺失將導(dǎo)致肝細(xì)胞中酪氨酸的毒性代謝產(chǎn)物無(wú)法正常代謝，持續(xù)性積累會(huì)引發(fā)肝損傷，造成Ⅰ型遺傳性酪氨酸血癥[40-41]。但在沒有干預(yù)措施下，F(xiàn)AH基因敲除豬在妊娠期間即會(huì)導(dǎo)致胚胎致死，因此需要依賴特定的藥物才能保證出生和存活。

綜上所述，利用基因編輯技術(shù)在無(wú)菌環(huán)境下制備的GTKO/FAHKO/Rag2KO/IL2RGKO小型豬可以作為直接培育人源化器官的來(lái)源，這種方式也是解決異種肝臟移植物不能長(zhǎng)期存活的一種可行方案。然而，培育人源化肝臟嵌合體豬是異種肝移植的技術(shù)高地，存在嵌合細(xì)胞占比低等問題。并且，該培育方式尚存較多技術(shù)難點(diǎn)，包括基因編輯技術(shù)、克隆技術(shù)和胚胎定向注射干細(xì)胞技術(shù)等均存在較大的挑戰(zhàn)。此外，F(xiàn)AH敲除豬的藥物維持劑量、剖腹產(chǎn)仔豬的人工培養(yǎng)方案等還需要進(jìn)行深入研究，加之DPF凈化設(shè)施的必要性，使整體研究投入較大且實(shí)驗(yàn)存在較多的不確定性。以上技術(shù)難點(diǎn)及其他各方面問題均制約了該方案的開展。但相信隨著異種腎臟、心臟的移植逐步進(jìn)入臨床研究階段并取得一定成果，將有更多的研究者致力于異種肝臟移植研究，人源化肝臟嵌合體豬也將成功培育。

3 小結(jié)與展望

隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，可以通過(guò)對(duì)供體豬進(jìn)行基因改造和利用人源化細(xì)胞獲得肝臟嵌合體來(lái)解決異種肝移植后的免疫排斥及生理功能不匹配的雙重問題。首先，對(duì)于未來(lái)用于異種肝移植供體豬的基因型組合，筆者認(rèn)為α-Gal，Neu5Gc對(duì)于抑制急性排斥反應(yīng)是抗原敲除的必要選擇，CD47以及ASGR1是抑制異種肝移植術(shù)后血小板減少癥等的必需基因，對(duì)于人源補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白可以采取單個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)入。與此同時(shí)，最重要的是要補(bǔ)充人體凝血因子及共刺激阻斷劑等免疫抑制劑方案。通過(guò)以上方式不僅有希望大大改善異種肝移植的排斥反應(yīng)，且可以延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間，使得基因編輯豬可以更好地發(fā)揮“橋接過(guò)渡”的作用。其次，在無(wú)菌環(huán)境下利用基因編輯技術(shù)制備GTKO/FAHKO/Rag2KO/IL2RGKO小型豬可作為直接培育人源化器官的來(lái)源，這種方式是解決移植物長(zhǎng)期存活問題的另一途徑。雖然，目前培育人源化肝臟嵌合體豬面臨著嵌合細(xì)胞占比低，基因編輯及克隆技術(shù)等問題。但隨著越來(lái)越多研究者的關(guān)注和研究，相信人源化肝臟嵌合體豬和理想的多基因編輯豬也將被成功培育，以突破異種肝移植目前存在的障礙，推動(dòng)異種肝移植向臨床應(yīng)用更靠近一步，為等待肝移植的患者和家庭帶來(lái)福音。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：淮國(guó)麗負(fù)責(zé)獻(xiàn)收集，撰寫論及修改；杜嘉祥參與基因編輯部分內(nèi)容的指導(dǎo)和修改；潘登科提供章思路，指導(dǎo)撰寫及修改。