李康偉， 尉 丁， 張若涵， 李 霄， 陶開山

1 第四軍醫(yī)大學 a.研究生院， b.基礎(chǔ)醫(yī)學院細胞生物學教研室， 西安 710032；2 第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院 肝膽胰脾外科， 西安 710032

原發(fā)性肝癌根據(jù)病理分型可劃分為肝細胞癌(HCC)、肝內(nèi)膽管癌以及混合型肝癌。其中HCC約占原發(fā)性肝癌的90%[1]，已經(jīng)成為全球惡性腫瘤相關(guān)死亡的第四大原因[2]。在我國，肝炎相關(guān)肝硬化是HCC常見的發(fā)病原因，且大多數(shù)患者在就診時腫瘤已發(fā)生轉(zhuǎn)移[3]，此時患者無法滿足手術(shù)治療指征，喪失了最佳治療時機。

大部分HCC患者需要接受綜合性治療，如手術(shù)切除、微波消融、肝動脈灌注化療栓塞術(shù)、放療、化療和腫瘤靶向藥物治療。肝移植僅限用于少部分患者，且肝源短缺。目前，外科手術(shù)仍是可切除肝癌最優(yōu)先的治療方案，然而肝癌術(shù)后5年復(fù)發(fā)患者高達70%～80%[4]，其他常規(guī)治療策略往往不能達到令人滿意的療效。聯(lián)合索拉非尼、瑞戈非尼行靶向治療，部分患者也僅能增加短短數(shù)月的總生存期[5]。因此，迫切需要新的、有效的治療方案應(yīng)用于HCC治療。隨著免疫治療的發(fā)展，目前較具有研究前景的是嵌合抗原受體T淋巴細胞(chimeric antigen receptor T cell, CAR-T)免疫療法。

1 CAR-T免疫療法概述

腫瘤免疫治療領(lǐng)域在過去的幾十年中取得了飛速的進步，腫瘤免疫治療主要包括單克隆抗體、免疫檢查點抑制劑、細胞疫苗和過繼性T淋巴細胞療法等[6]。CAR-T為過繼性T淋巴細胞療法之一，是一種頗具研究潛力且已經(jīng)取得臨床突破的免疫療法，其基本原理是將患者的T淋巴細胞通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)獲得能夠識別特定抗原的特異性T淋巴細胞，再重新回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，與腫瘤相關(guān)表面抗原結(jié)合，并激活免疫反應(yīng)從而破壞腫瘤細胞[7]。

CAR-T免疫療法融合了抗體對抗原的高特異性與T淋巴細胞殺傷靶腫瘤的細胞毒性這兩種優(yōu)點[8]。其基本構(gòu)造分為3個部分：胞外抗原識別結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和促進細胞因子分泌的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域。CAR-T免疫療法至今已發(fā)展到第五代。第1代因其在體內(nèi)增殖，能力較差，抗腫瘤能力存在很大的局限性。隨后研究人員在胞內(nèi)段引入?yún)f(xié)同共刺激分子增加CAR-T的抗腫瘤效果，加入1個共刺激分子稱為第2代。第3代加入2個協(xié)同共刺激分子，顯著提升CAR-T的抗腫瘤作用。第4代增加了新的細胞因子序列，使CAR-T能夠在病灶區(qū)域分泌增強抗腫瘤免疫反應(yīng)的細胞因子[9]。第5代CAR-T在此基礎(chǔ)上增加了細胞因子受體的胞內(nèi)段序列，被用來誘導(dǎo)細胞因子信號，進一步促進細胞增殖，作用更加持久[10]。CAR-T識別特定抗原信號后激活并殺傷腫瘤細胞，激活后CAR-T可在體內(nèi)復(fù)制增殖以產(chǎn)生較為持久的療效，并釋放具有趨化作用的細胞因子引起其他免疫細胞聚集共同殺傷腫瘤細胞。2017年10月，全球首個CD19 CAR-T正式批準應(yīng)用于治療成人彌漫大B細胞淋巴瘤，臨床研究[11]結(jié)果顯示，接受治療12個月后，疾病無復(fù)發(fā)率為64%，存活率達到79%。在血液系統(tǒng)惡性腫瘤取得較好療效的同時，實體腫瘤的臨床試驗也在陸續(xù)開展。

2 CAR-T免疫療法在原發(fā)性肝癌治療中的應(yīng)用

目前，臨床試驗[12]數(shù)據(jù)已證實CAR-T免疫療法具有良好的抗腫瘤效應(yīng)。CAR-T可以直接殺傷腫瘤細胞，而裂解的腫瘤細胞碎片與腫瘤相關(guān)抗原可發(fā)揮免疫激活劑的作用正向調(diào)節(jié)機體免疫細胞對腫瘤的殺傷作用。由于同時具有細胞免疫和體液免疫的優(yōu)點，CAR-T可能成為原發(fā)性肝癌治療的一種有效手段[13]。在我國，CAR-T免疫療法逐漸成為臨床研究熱點。2017年，我國超過美國成為CAR-T免疫療法臨床試驗數(shù)量第一的國家[14]。根據(jù)ClinicalTrial.gov數(shù)據(jù)，截至2021年底，全球肝癌CAR-T研究項目48項，我國有32項(67%)。

Wang等[15]開展的一項CD133-CAR-T研究，共入組23例晚期惡性腫瘤受試者，包括HCC受試者14例，其中2例腫瘤低負荷(腫瘤直徑<5 cm)的HCC受試者獲得了最長的疾病穩(wěn)定持續(xù)時間，分別為13.7個月和15.2個月；HCC受試者的中位無進展生存期為7個月；3個月疾病控制率為64%，6個月疾病控制率為43%。另一項靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)CAR-T治療HCC的 Ⅰ 期臨床試驗[16]結(jié)果顯示：患者6、24和36個月的總生存率分別為50.3%、42.0%和10.5%。本研究中心開展的一項CD147-CAR-T的Ⅰ期臨床試驗中，最低劑量組(8×106個CAR-T細胞)的3例患者治療后腫瘤病灶縮小，腫瘤標志物水平下降，較高劑量組(24×106個CAR-T細胞)目前仍在進行觀察，期待獲得更好的療效。國際上其他針對HCC的CAR-T臨床試驗也取得了一些成果，但仍面臨部分需要解決的問題[17]。

3 CAR-T免疫療法在原發(fā)性肝癌治療中面臨的困難與問題

CAR-T免疫療法在實體瘤治療中主要未解決的難點在于腫瘤部位浸潤不良和T淋巴細胞抑制[18]，通過趨化因子受體改善T淋巴細胞的運輸是提高CAR-T發(fā)揮作用的可靠方法[19]，解決腫瘤部位浸潤不良和T淋巴細胞抑制是CAR-T治療實體瘤獲得成功的突破口。

3.1 缺乏腫瘤特異性抗原 靶抗原的選擇是CAR-T免疫療法應(yīng)用于原發(fā)性肝癌治療首先面臨的難題，腫瘤靶抗原應(yīng)在腫瘤細胞特異性表達，而在身體重要器官不表達，減少對人體正常組織產(chǎn)生的毒副作用。AFP、CEA、GPC-3、MUC-1、CD133、CD147等通常在HCC中過度表達，而在正常組織中表達水平很低，是潛在的治療靶點[20-22]。其中，CD147也被稱為細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)劑，是一種高表達于癌細胞的跨膜糖蛋白，在原發(fā)性肝癌患者中陽性率高達80%，與肝癌細胞的集體侵襲有關(guān)[23]，并且與患者總生存率呈負相關(guān)[24]，可作為腫瘤治療的靶點。一般情況下，表達高水平靶抗原的腫瘤細胞會被CAR-T優(yōu)先清除，而表達靶抗原水平較高的正常組織細胞亦會受到攻擊。為減少對正常組織的損傷，特異性識別腫瘤細胞，Chen等[25]報道了一種針對HCC靶向雙抗原的CAR-T，只有同時表達GPC-3和ASGR1(一種肝組織特異性蛋白)2種抗原的腫瘤細胞才可以被識別，進而激活CAR-T殺傷腫瘤細胞。這些靶向雙抗原的CAR-T不會識別單獨表達單一抗原的正常組織，從而使殺傷作用更加精確，降低了因誤傷人體正常組織引起不良反應(yīng)的風險，但這可能導(dǎo)致表達單一靶向抗原的腫瘤細胞逃逸。Tang等[26]使用溶瘤病毒將腫瘤靶點特異性導(dǎo)入腫瘤細胞，使靶抗原陰性的腫瘤細胞表達靶抗原，減少腫瘤細胞的逃逸現(xiàn)象。另一方面，溶瘤病毒對癌細胞的直接裂解作用導(dǎo)致腫瘤相關(guān)抗原釋放，CAR-T和溶瘤病毒的結(jié)合可以增加CAR-T運輸，提高抗腫瘤作用以及消除抗原陰性腫瘤細胞。

3.2 CAR-T對腫瘤組織的浸潤性差 CAR-T向腫瘤中浸潤和駐留在實體瘤中起著重要的作用，但腫瘤相關(guān)成纖維細胞和異常的血管形成了致密的物理屏障，這種物理屏障和肝臟免疫抑制環(huán)境導(dǎo)致CAR-T較難滲入腫瘤組織[27]。Adachi等[28]研究認為，部分趨化因子(IL-7等)可以顯著促進CAR-T浸潤到腫瘤組織，也可以通過腫瘤動脈局部給藥的方式增加CAR-T在腫瘤組織中的駐留，能夠獲得比靜脈給藥更好的抗腫瘤效果。巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中是浸潤率最高的免疫細胞，Chen等[29]試圖利用CAR修飾的巨噬細胞對抗實體瘤，然而巨噬細胞難以在體內(nèi)增殖，療效有限。另外有學者[30]設(shè)想設(shè)計一種可同時殺傷成纖維細胞的CAR-T，降解纖維結(jié)締組織，以促進CAR-T浸潤。

3.3 腫瘤微環(huán)境抑制CAR-T活性 與其他實體腫瘤一樣，CAR-T在肝癌組織中的生長增殖遠不及血液系統(tǒng)腫瘤。原發(fā)性肝癌腫瘤組織由腫瘤細胞和基質(zhì)細胞組成(成纖維細胞、腫瘤相關(guān)巨噬細胞等)，伴隨迂曲畸形的血管和致密的纖維結(jié)締組織，細胞過度的有氧酵解和血液灌注不良造成腫瘤微環(huán)境的基本特點是缺氧和低pH值[31]。Meng等[32]證實酸性條件可以通過上調(diào)HCC組織中受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1的表達，顯著促進癌細胞的遷徙，而碳酸氫鈉治療可以改善腫瘤組織的低pH值，從而減少腫瘤轉(zhuǎn)移。此外，我國HCC往往建立在慢性炎癥的基礎(chǔ)之上，患者由肝炎進展為肝硬化再轉(zhuǎn)變?yōu)楦伟?，因此腫瘤和潛在的慢性肝臟炎癥共同塑造了腫瘤細胞生長的微環(huán)境。此外，肝腫瘤中存在的免疫抑制細胞(如功能失調(diào)的調(diào)節(jié)性T淋巴細胞和肝星狀細胞)抑制T淋巴細胞增殖和自然殺傷細胞活性，保護腫瘤逃避免疫攻擊。肝腫瘤通過腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)的免疫抑制機制逃避免疫反應(yīng)[33-34]，在肝腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中占重要地位，并且與腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)。在這種微環(huán)境中，CAR-T存活困難，難以達到理想的殺傷腫瘤效果。改善低氧、低pH的腫瘤微環(huán)境并聯(lián)合使用抗病毒藥物可有效提高CAR-T殺傷腫瘤的療效。

4 CAR-T免疫療法的安全性

CAR-T免疫療法相關(guān)的2種最常見的不良反應(yīng)為細胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome,CRS)和神經(jīng)毒性綜合征(neurotoxicity syndrome,NT)。

CRS是由CAR-T釋放大量細胞因子(IFNγ、IL等)和趨化因子(CCL2、CXCL8等)而引起的炎癥反應(yīng)[35]。輸注CAR-T后，T淋巴細胞迅速擴增，從而產(chǎn)生與巨噬細胞激活相關(guān)的炎癥狀態(tài)，隨后多種細胞因子水平升高(IL-6、IFNγ等)，導(dǎo)致內(nèi)皮激活、血管內(nèi)凝血、血腦屏障通透性增加以及腦膜炎癥[36]。CRS表現(xiàn)為全身癥狀，如發(fā)熱、寒戰(zhàn)、全身疼痛，可迅速進展為呼吸急促、缺氧、低血壓、心率加快、毛細血管滲漏、休克，其首發(fā)癥狀通常為發(fā)熱[37]。對于發(fā)熱等非特異性全身癥狀，主要是對癥支持治療，即應(yīng)用退熱藥和補液。Hariri等[38]認為白蛋白對CRS患者更有效，因為其可以降低毛細血管滲漏和肺水腫的風險。對于嚴重的CRS(以發(fā)熱、缺氧和升壓藥維持血壓為特征)，通常采用托珠單抗注射液(一種抗IL-6抗體)進行治療。

CRS的治療和管理已逐步完善，但對NT的研究和治療仍在探索中。Mackall等[39]研究發(fā)現(xiàn)，由炎癥和細胞因子增加引起的血腦屏障破壞是NT發(fā)生的關(guān)鍵啟動因素。NT可能表現(xiàn)為譫妄、腦病、失語、嗜睡、注意力不集中、激動、震顫、癲癇發(fā)作，以及罕見的腦水腫[40]，嚴重CRS和NT風險增加的患者建議應(yīng)用大劑量皮質(zhì)類固醇(地塞米松、甲潑尼龍)治療[41]。上述2種常見的不良反應(yīng)在給予對癥支持治療后可緩解，僅少數(shù)患者會發(fā)生嚴重不良反應(yīng)[42]，臨床中發(fā)現(xiàn)，相較于血液系統(tǒng)腫瘤的CAR-T治療，實體瘤CAR-T治療的不良反應(yīng)發(fā)生率相對較低，為實體瘤CAR-T臨床試驗的順利開展提供了保障。

5 小結(jié)與展望

CAR-T免疫療法對肝癌等實體惡性腫瘤的治療尚處于大量臨床試驗階段，目前已經(jīng)取得了一定的成果。缺乏特異性抗原靶點、腫瘤微環(huán)境抑制、CAR-T在肝癌組織中浸潤性差是CAR-T免疫療法應(yīng)用于肝癌治療的主要障礙。此外，其安全性以及副作用也是需要關(guān)注的問題，但各種實體腫瘤的第一階段數(shù)據(jù)表明，CAR-T治療較為安全，毒副作用可控。相信隨著CAR-T免疫療法的不斷改進和完善，將取得更好的療效。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：李康偉起草并撰寫文章主要內(nèi)容；尉丁負責協(xié)助補充文獻并完善文章內(nèi)容；張若涵負責主要內(nèi)容修改；李霄協(xié)助文章修改及審校；陶開山指導(dǎo)文章思路并修改了文章關(guān)鍵內(nèi)容。