賈時(shí)榮，何 洪，安風(fēng)平，曾紹校，王藝偉，宋洪波

（1.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建省特種淀粉品質(zhì)科學(xué)與加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002）

鐵是一種重要的人體所需礦物質(zhì)，在代謝過程和免疫功能方面發(fā)揮重要作用[1]。缺鐵可導(dǎo)致缺鐵性貧血或功能障礙，在所有年齡人群中均較普遍[2]，通常由于缺鐵、難以吸收鐵或大量流失所致[3]。目前，無機(jī)鐵（如硫酸亞鐵等）是常用的鐵補(bǔ)充劑，但易產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化和胃腸道副作用[4-5]。因此，有機(jī)鐵補(bǔ)充劑的研究受到關(guān)注，如多糖鐵、多肽鐵、氨基酸鐵、血紅素鐵、富鐵酵母等，主要以分子形式吸收，避免了鐵離子導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化和胃腸道副作用[4，6]。多糖易與鐵離子作用形成復(fù)合物，不僅具有有機(jī)鐵的優(yōu)點(diǎn)，還保留了多糖的部分生物活性[7]。多糖鐵復(fù)合物的化學(xué)組成及其結(jié)構(gòu)是消化吸收的基礎(chǔ)，此方面的研究鮮見報(bào)道。

有研究表明，超高壓處理可以改變蛋白質(zhì)、淀粉等生物大分子結(jié)構(gòu)[8]，用于制備蓮子直鏈淀粉-脂肪酸復(fù)合物取得良好效果[9]，這為超高壓制備多糖鐵復(fù)合物提供了可能性。黑茶屬后發(fā)酵茶，通常選擇成熟度較高的鮮葉加工，具有老茶的特點(diǎn)[10]，其多糖含量普遍高于新葉[11]。因此，以黑茶多糖為基礎(chǔ)材料，研究超高壓制備黑茶多糖鐵復(fù)合物的化學(xué)組成與結(jié)構(gòu)特性，為進(jìn)一步研究其消化利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

原料：黑茶，中茶湖南安化第一茶廠有限公司提供。

試劑：FeCl3、NaOH、無水乙醇、K4[Fe(CN)6]、苯酚、硫酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、鹽酸、醋酸、鄰菲羅啉、檸檬酸三鈉、鹽酸羥胺、三氟乙酸、PVP-P、Na2CO3，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；沒食子酸、PMP、乙腈、氯仿、ACS，上海阿拉丁生物科技有限公司提供；福林酚、牛血清蛋白（BSA）、3 500 U透析袋、葡萄糖標(biāo)品，北京索萊寶生化技術(shù)公司提供；鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、巖藻糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、核糖，上海源葉生物科技有限公司提供；木糖、葡萄糖，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

JHBE-20A型閃式提取儀，上海釩幟精密設(shè)備有限公司產(chǎn)品；5L-HPP600 MPa型靜態(tài)超高壓設(shè)備，包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品；TGL-16型醫(yī)用冷凍離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司產(chǎn)品；Agilent-1200型高效液相色譜，美國安捷倫科技公司產(chǎn)品；FTIR-8400S型傅立葉變換紅外光譜儀、UV-1780型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品；TENSOR 27型X射線粉末衍射儀，德國布魯克公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑茶多糖提取

將黑茶粉碎，過60目篩，料液比1∶55（W/V），閃式提取器電壓170 V，提取107 s；以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心10 min，乙醇沉淀10 h，凈水復(fù)溶濃縮后冷凍干燥得黑茶粗多糖。取15 g粗多糖溶于300 mL水中，加3 g PVP-P攪拌10 min，于20℃下以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心10 min，取上清液重復(fù)上述步驟3次，濃縮后3 500 U透析袋透析48 h，冷凍干燥得黑茶多糖（DTP）。

1.3.2 多糖鐵復(fù)合物的制備

加熱法制備黑茶多糖鐵復(fù)合物（DTPIC-HW）：取0.2 g DTP溶于10 mL水中，加入0.1 g檸檬酸三鈉，用HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH值至8，按質(zhì)量比1.7∶1加入濃度為0.89 mmol/mL的FeCL3溶液，于60℃水浴中振蕩反應(yīng)1 h，以轉(zhuǎn)速7 000 r/min離心10 min；4倍量乙醇沉淀1 h，以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心10 min，加水復(fù)溶后3 500 U透析袋透析48 h，冷凍干燥。

超高壓法制備黑茶多糖鐵復(fù)合物（DTPIC-HP）：有別于加熱法，反應(yīng)過程是將待處理溶液裝入塑料袋密封，于超高壓設(shè)備中425 MPa處理22 min。其他步驟同上。

1.3.3 多糖鐵復(fù)合物成分測(cè)定

（1）定性分析。參考2015版《中華人民共和國藥典（四部）》，取適量茶多糖粉末，加水配制1 mg/mL溶液，將FeCl3（2 mol/L）溶液滴加至沸騰水中直至變?yōu)榧t棕色，得到Fe(OH)3溶膠；取1 mL待測(cè)樣品溶液，一式3份，分別用NaOH溶液、無水乙醇、K4[Fe(CN)6]溶液進(jìn)行鑒定。

（2）化學(xué)成分測(cè)定。中性糖：采用苯酚-濃硫酸法[12]測(cè)定多糖得率，以中性糖含量為考查指標(biāo)。鐵：采用Lu Q等人[13]的方法稍作修改。取0.01 g樣品溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的HCl溶液50 mL中，取1 mL溶液置于25 mL具塞試管中，依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的HCl液1 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的鹽酸羥胺溶液1 mL，室溫反應(yīng)1 h；再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%的鄰菲羅啉2 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的醋酸鈉溶液5 mL，加入適量去離子水使溶液總體積為25 mL，室溫反應(yīng)15 min。于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定溶液吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=0.008 4X-0.004 8；R2=0.999 3）計(jì)算鐵離子含量。糖醛酸：采用間羥基聯(lián)苯法[14]，以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，于波長(zhǎng)520 nm處測(cè)定溶液吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=0.007 4X+0.019 7；R2=0.995 7）計(jì)算糖醛酸含量。蛋白質(zhì)的測(cè)定采用Bradford法[15]，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，于波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=0.005 4X+0.009 4；R2=0.991 5）計(jì)算蛋白質(zhì)含量。多酚的測(cè)定采用福林酚法[16]，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，于波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=0.009 5X+0.027 3；R2=0.997 8）計(jì)多酚含量。

1.3.4 結(jié)構(gòu)表征

（1）單糖組成的測(cè)定。采用高效液相色譜法測(cè)定。取15 mg樣品于水解管中，加入濃度為4 mol/L的TFA（三氟乙酸）溶液1 mL，于120℃下加熱水解2 h；用氮?dú)獯蹈?，加入濃度?.5 mol/L PMP-甲醇溶液1 mL及濃度為0.3 mol/L的NaOH溶液0.5 mL，70℃水浴加熱60 min，冷卻；再加入濃度為0.3 mol/L的HCl溶液0.5 mL和氯仿0.5 mL，振蕩后靜置20 min，棄去有機(jī)層，萃取3次，取水層過濾膜。色譜條件：SHISEIDO C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相0.1 mol/L KH2PO4（pH值6.8）/乙腈=82/18，流速1.0 mL/min，柱溫25℃進(jìn)樣量10 μL，于波長(zhǎng)245 nm處測(cè)定吸光度。

（2）紅外光譜（FTIR）分析。稱取5 mg樣品與500 mg KBr混合，充分研磨后壓片，傅立葉紅外光譜儀進(jìn)行定性檢測(cè)。以4 cm-1的分辨率，4 000～400 cm-1的波數(shù)掃描32次。

（3）X-射線衍射（XRD）分析。稱取50 mg樣品進(jìn)行X-射線衍射掃描。Cuk-α為X射線源，0.02°步長(zhǎng)，2θ=5~90°范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS（17.0）軟件，數(shù)據(jù)通過One-way ANOVA方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，采用鄧肯法進(jìn)行事后檢驗(yàn)，p＜0.05具有顯著性差異，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性分析

黑茶多糖鐵的定性分析見表1。

表1 黑茶多糖鐵的定性分析

由表1可知，將DTPIC-HW和DTPIC-HP溶于水后呈淡黃色，而Fe(OH)3溶液則為紅棕色。加入NaOH后，DTPIC-HW和DTPIC-HP溶液無沉淀，而Fe(OH)3溶液產(chǎn)生沉淀，這反映了多糖和Fe(OH)3在堿性條件下的應(yīng)有性質(zhì)；加入無水乙醇后，DTPIC-HW和DTPIC-HP均產(chǎn)生沉淀，而Fe(OH)3未發(fā)生沉淀現(xiàn)象，說明DTPIC-HW和DTPIC-HP仍具有多糖的性質(zhì)；加入K4Fe(CN)6后，DTPIC-HW和DTPIC-HP未發(fā)生明顯的顏色變化，而Fe(OH)3生成了藍(lán)色沉淀，說明2種黑茶多糖水溶液中均不存在游離Fe3+。

2.2 化學(xué)成分分析

黑茶多糖鐵化學(xué)成分分析見表2。

表2 黑茶多糖鐵化學(xué)成分分析

由表2可知，DTP中含有中性糖、糖醛酸，少量的蛋白質(zhì)和多酚。DTPIC-HW和DTPIC-HP中的主要成分是中性糖、糖醛酸和鐵，這是因?yàn)樵谥苽溥^程中堿性條件使DTP中的多酚、蛋白與鐵離子形成沉淀，在后續(xù)醇沉和透析被去除。與DTP相比，2種多糖鐵中的中性糖和糖醛酸含量均顯著降低，主要原因一方面是由于多糖鐵中含有一定量的鐵，使樣品中的中性糖和糖醛酸相對(duì)含量降低；另一方面由于水分子參與復(fù)合物中“鐵核”的形成，產(chǎn)物中引入了一定量的結(jié)合水，也使得等質(zhì)量樣品中的中性糖含量降低[17]。DTP中的中性糖與糖醛酸的比例為2.53，而DTPIC-HW中的中性糖與糖醛酸的比例為8.4，表明其中的糖醛酸明顯減少，是由于熱堿性條件下糖醛酸與鐵離子相互作用造成的[18]；DTPIC-HP中的中性糖與糖醛酸比例為2.15，鐵含量顯著高于DTPIC-HW中的（p＜0.05），說明常溫超高處理使得更多的鐵與中性糖及糖醛酸結(jié)合。

2.3 單糖組成分析

黑茶多糖及不同黑茶多糖鐵的單糖組成分析見表3。

表3 黑茶多糖及不同黑茶多糖鐵的單糖組成分析

由表3可知，茶多糖及多糖鐵均含有巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、鼠李糖等中性多糖，半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等酸性多糖。與DTP相比，DTPIC-HW和DTPIC-HP中的單糖組成比例均發(fā)生不同程度變化，說明因加熱或超高壓制備方法的不同，茶多糖鐵中的單糖組成比例亦產(chǎn)生差異。

黑茶多糖及不同黑茶多糖鐵的典型單糖比值見表4。

表4 黑茶多糖及不同黑茶多糖鐵的典型單糖比值

由表4可知，DTP、DTPIC-HW和DTPIC-HP中典型單糖比值結(jié)果，用于判斷樣品是否含有RG-I結(jié)構(gòu)并評(píng)估RG-I結(jié)構(gòu)側(cè)鏈長(zhǎng)短。RG-I結(jié)構(gòu)是植物酸性多糖的一種亞結(jié)構(gòu)，鼠李糖與半乳糖醛酸的比值（即Rha/GalA）為0.05～1.00時(shí)表明包含這一結(jié)構(gòu)[19]；RG-I的側(cè)鏈含有半乳糖和阿拉伯糖，而半乳糖與阿拉伯糖之和與鼠李糖的比值（即（Gal+Ara）/Rha）可評(píng)估RG-I的側(cè)鏈長(zhǎng)短[20]。結(jié)果表明，DTP中Rha/GalA為0.50，說明其含有RG-I結(jié)構(gòu)，這與Chen G等人[21]對(duì)熱水浸提法提取的黑茶多糖的試驗(yàn)結(jié)果（0.28～0.55）相符。DTPIC-HW中Rha/GalA為5.36，表明RG-I結(jié)構(gòu)被破壞，可能是由糖鏈上的半乳糖醛酸與鐵離子螯合導(dǎo)致的；（Gal+Ara）/Rha為3.65，表明加熱法制備法使得多糖側(cè)鏈變短。DTPIC-HP中Rha/GalA為0.43，說明超高壓制備的茶多糖鐵更好地保留了RG-I的結(jié)構(gòu)；（Gal+Ara）/Rha為8.93，高于DTP，說明DTPIC-HP的RG-I結(jié)構(gòu)上可能連接了更長(zhǎng)的側(cè)鏈。

2.4 紅外光譜分析

黑茶多糖及不同黑茶多糖鐵的FT-IR光譜圖譜見圖1。

圖1 黑茶多糖及不同黑茶多糖鐵的FT-IR光譜圖譜

由圖1可知，DTP、DTPIC-HW和DTPIC-HP均在3 397 cm-1處有吸收峰，為多糖羥基結(jié)構(gòu)的伸縮振動(dòng)[22]。2 930 cm-1和1 236 cm-1處產(chǎn)生的吸收峰為DTP中C-H結(jié)構(gòu)的伸縮振動(dòng)所致，而DTPIC-HW和DTPIC-HP圖譜中此吸收峰強(qiáng)度不同程度減弱，且波數(shù)移至2 941 cm-1和1 258 cm-1，說明鐵與多糖復(fù)合過程中影響了C-H的結(jié)合強(qiáng)度[23]。1 720 cm-1處吸收峰為DTP中COO-的特征吸收[24]，而DTPIC-HP圖譜中此吸收峰減弱，DTPIC-HW圖譜中此峰消失；1 622 cm-1和1 419 cm-1處的吸收峰是DTP中C=O和C-O的伸縮振動(dòng)[25]，螯合鐵后DTPIC-HW和DTPIC-HP中此2個(gè)特征峰均向低波數(shù)（1 607 cm-1和1 393 cm-1）偏移，表明羧基和羥基不同程度參與了鐵離子與DTP的結(jié)合。1 088 cm-1和901 cm-1處的吸收峰是DTP中C-O-C伸縮振動(dòng)和C-C伸縮振動(dòng)[26]，而DTPIC-HW和DTPIC-HP中這2個(gè)特征峰均發(fā)生了偏移（1 074 cm-1和918 cm-1）。在指紋區(qū)（1 000～400 cm-1），DTPIC-HW和DTPIC-HP出現(xiàn)了2個(gè)新的吸收峰（853 cm-1和692 cm-1），這是β-FeOOH的特征峰[27]，表明鐵與DTP螯合成功，并且以β-FOOH的形式存在。

2.5 X-射線衍射分析

黑茶多糖及不同黑茶多糖鐵的XRD圖譜見圖2。

圖2 黑茶多糖及不同黑茶多糖鐵的XRD圖譜

由圖2可知，3個(gè)樣品在2θ=0～80°無明顯的強(qiáng)吸收峰，說明茶多糖和茶多糖鐵均無結(jié)晶區(qū)域，呈無定形態(tài)[28]。與DTP的圖譜相比，DTPIC-HW和DTPIC-HP出現(xiàn)了凸起的衍射峰，特別是DTPIC-HP凸起衍射峰（5°＜2θ＜15°）較DTPIC-HW的凸起衍射峰（5°＜2θ＜25°）更窄、強(qiáng)度更大，一方面說明鐵離子能夠與茶多糖配位形成新的螯合物；另一方面也說明超高壓較加熱制備茶多糖鐵中的鐵離子在糖鏈上的分布更為集中。

3 結(jié)論

常溫超高壓法和加熱法均可有效地將鐵離子與黑茶多糖螯合，且不形成結(jié)晶區(qū)。DTPIC-HP中鐵含量為16.73，顯著高于DTPIC-HW的12.77%；前者的中性糖與糖醛酸比例為2.15，顯著小于后者的8.40。黑茶多糖鐵及黑茶多糖的單糖組成相同，但DTPIC-HW和DTPIC-HP中的單糖組成比例發(fā)生不同變化；DTPIC-HP的側(cè)鏈長(zhǎng)度有所增加，而DT PIC-HW的鏈長(zhǎng)變短。由此表明，DTPIC-HP的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)特性優(yōu)于DTPIC-HW。