孫亞婷，賈瑤，朱愛珍

(運(yùn)城市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，運(yùn)城 044000)

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)取得了一定進(jìn)展。周團(tuán)萍等[1]的研究表明卵母細(xì)胞體內(nèi)或體外成熟過程中線粒體相關(guān)凋亡因子2(AIFM2)和鐵氧化還原蛋白1(FDX1)都參與了卵母細(xì)胞成熟過程，且體內(nèi)和體外成熟的卵丘細(xì)胞AIFM2和FDX1表達(dá)水平無顯著差異，但體外成熟的卵母細(xì)胞發(fā)育潛能仍不理想。有研究表明，體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟率、受精率和囊胚形成率均低于體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞[2]。體外成熟還影響人卵母細(xì)胞的基因表達(dá)譜，涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、胚胎發(fā)生、表觀遺傳學(xué)、發(fā)育和細(xì)胞周期的幾個(gè)基因[3]，體外成熟還有待進(jìn)一步優(yōu)化。因此為深入理解卵母細(xì)胞成熟的分子機(jī)制，本研究選用體內(nèi)成熟各階段的卵母細(xì)胞為研究對象。

卵母細(xì)胞成熟是指從生發(fā)泡(GV)階段到第2次減數(shù)分裂中期的減數(shù)分裂過程[4]。該過程的首要表現(xiàn)是在光鏡下觀察到生發(fā)泡的消失，稱為生發(fā)泡破裂(GVBD)。GVBD后，卵母細(xì)胞通過第1次減數(shù)分裂中期(MⅠ)，隨后第一極體排出進(jìn)入第2次減數(shù)分裂并停滯在第2次減數(shù)分中期(MⅡ)直到受精發(fā)生。GVBD的啟動受卵細(xì)胞成熟促進(jìn)因子(MPF)的激活調(diào)控。MPF是異二聚體，由催化亞單位——細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶-1(CDK1，又被稱為cdc2或p34cdc2)和調(diào)節(jié)亞單位——細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白B(cyclinB)組成[5]。CDK1的分子量是34 kDa，通過與cyclin B結(jié)合形成MPF，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂成熟[6-8]，在未成熟卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)中起重要作用[9]。但是卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟過程中CDK1蛋白和mRNA表達(dá)水平的變化及其相關(guān)性尚不清楚。本研究通過分別檢測GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母細(xì)胞CDK1蛋白及其mRNA的表達(dá)，闡明CDK1蛋白和CDK1 mRNA在小鼠卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟過程中的變化趨勢和相關(guān)性，為進(jìn)一步深入探討卵母細(xì)胞成熟機(jī)制奠定一定基礎(chǔ)。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動物

二、實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

孕馬血清促性腺激素(PMSG，M2620)、人絨毛膜促性腺激素(HCG，M2520)、M2培養(yǎng)基(M1250)和即用型透明質(zhì)酸酶(M2215)均購自南京愛貝生物；放射免疫沉淀法緩沖液(RIPA裂解液，P0013B)、磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS，ST447)、Tris緩沖鹽溶液(TBS，ST667)、含聚山醇脂-20的TBS(TBSTw，ST673)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(6×，P0015F)、100 mmol/L苯甲基硫酰氟(PMSF，ST506)、Tris-硼酸-EDTA緩沖液(TBE，ST723)、InstantViewTM紅色熒光DNA ladder(D0117S)和InstantViewTM紅色熒光DNA上樣緩沖液(D0081)均購自上海碧云天生物；BCA法蛋白定量試劑盒(PQ0012)購自杭州聯(lián)科生物；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(AR0138)和Tris-glycine-SDS電泳緩沖液(AR0139)均購自武漢博士德生物；Meilunbiofg超靈敏ECL發(fā)光試劑(MA0186-1)購自大連美侖生物；兔抗小鼠CDK1抗體(77055S)和HRP-山羊抗兔IgG抗體(7074)購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗小鼠β-Actin多克隆抗體(20536-1-AP)購自美國Proteintech公司；蛋白marker(26616)購自美國賽默飛世爾；PVDF膜(R0BB30223)購自美國Merck Millipore公司；2M DTT(B645939)、CDK1引物和β-actin引物(B661202)購自上海生工生物；RNeasy Plus Micro試劑盒(Qiagen，74034)購自德國Qiagen公司；PrimeScriptTMRT with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(RR047A)和TB GreenPremix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)(RR820A)試劑盒均購自日本Takara公司；倒置顯微鏡(DMI3000 B)和體式顯微鏡(S6D)購自德國Leica公司；電泳儀(1645050)、高壓電泳儀(POWER PACTM HC)、半干轉(zhuǎn)膜儀(1703940)、全能成像系統(tǒng)(chemidoc MP)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測系統(tǒng)(CFX96 Deepwell)購自美國BIO-RAD公司。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.實(shí)驗(yàn)分組：將68只小鼠隨機(jī)分成4組，根據(jù)獲取卵母細(xì)胞的時(shí)期分為GV組、GVBD組、MⅠ組和MⅡ組，每組17只。每組11只小鼠獲取的卵母細(xì)胞用于Western blot實(shí)驗(yàn)，剩余6只小鼠獲取的卵母細(xì)胞用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。

2.GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母細(xì)胞的獲?。簠⒖贾拔墨I(xiàn)的給藥劑量[10]，給予6～8周齡SPF級ICR雌性小鼠腹腔注射PMSG 10 U。(1)GV期卵母細(xì)胞獲取方法：腹腔注射PMSG 48 h后，小鼠頸椎脫臼處死。無菌條件下暴露卵巢，將整個(gè)卵巢置于預(yù)熱的M2培養(yǎng)基(M1250)，沖洗兩次，用1 ml無菌注射器針頭撕成1 mm×1 mm×1 mm以下小塊。在立體顯微鏡下選擇大小適中、形狀規(guī)則的GV期卵母細(xì)胞。機(jī)械去除顆粒細(xì)胞等雜質(zhì)后將GV期卵母細(xì)胞收集到1.5 ml無菌離心管。(2)GVBD和MⅠ期卵母細(xì)胞獲取方法：小鼠腹腔注射PMSG 48 h后，注射HCG 10 U，4 h后卵巢獲取GVBD期卵母細(xì)胞，8 h后卵巢獲取MⅠ卵母細(xì)胞。(3)MⅡ期卵母細(xì)胞獲?。盒∈蟾骨蛔⑸銹MSG 48 h后，注射10 U HCG。12 h后，脫臼處死，無菌條件下暴露輸卵管，放入預(yù)熱的M2培養(yǎng)基，漂洗兩次，用1 ml無菌注射器針頭撕開，在立體顯微鏡下選擇MⅡ期卵母細(xì)胞。顆粒細(xì)胞等雜質(zhì)用透明質(zhì)酸酶(M2215)去除，將MⅡ期卵母細(xì)胞收集于1.5 ml無菌離心管中。

3.Western blot實(shí)驗(yàn)：使用含有1 mmol/L PMSF的150 μl RIPA裂解液分別從200個(gè)GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母細(xì)胞中提取總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒檢測每個(gè)蛋白樣品的濃度，各樣本上樣10 μg的總蛋白進(jìn)行10%的SDS-PAGE電泳分離條帶，然后將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜中。將PVDF膜在含5%脫脂牛奶的TBST中室溫封閉1 h后與TBST稀釋的兔抗小鼠CDK1一抗(1∶1 500)或兔抗小鼠β-Actin一抗(1∶7 500)在4℃過夜孵育后再與TBST稀釋的HRP-山羊抗兔IgG二抗(1∶4 500)室溫下孵育30 min。采用Meilunbiofg超靈敏ECL發(fā)光試劑進(jìn)行化學(xué)發(fā)光信號檢測。使用ChemiDocTM成像系統(tǒng)獲取圖像，使用ImageJ 1.8.0軟件對條帶強(qiáng)度進(jìn)行量化，β-actin作為內(nèi)參對照。每個(gè)實(shí)驗(yàn)使用不同的生物標(biāo)本重復(fù)3次。

4.RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR：每50～100個(gè)GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母細(xì)胞分別加入含有2 mmol/L DTT和4 ng/μl載體RNA的350 μl Buffer RLT Plus進(jìn)行裂解。然后按照RNeasy Plus Micro試劑盒說明書提取總RNA。使用PrimeScriptTMRT with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。CDK1和β-actin的逆轉(zhuǎn)錄引物為RT Primer Mix。沒有逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)作為陰性對照，以確認(rèn)cDNA中沒有基因組DNA污染。使用CFX96 Real-time PCR檢測系統(tǒng)，按照TB GreenPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。CDK1引物序列為，F(xiàn)：5’-AGTTCATGGATTCTTCACTCGT-3’，R：5’-GTGTGTACACTCGTATCGGTAT-3’。循環(huán)程序設(shè)置為：95℃，30 s(預(yù)變性)；95℃，5 s，60℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。將β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入InstantViewTM紅色熒光DNA上樣緩沖液后2%瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增條帶，以確認(rèn)特異性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、小鼠卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟過程中CDK1蛋白的表達(dá)

分別收集200個(gè)GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母細(xì)胞來研究CDK1蛋白表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參。Western blot結(jié)果顯示，CDK1蛋白在GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期均有表達(dá)(圖1A)；隨著卵母細(xì)胞的體內(nèi)成熟，CDK1蛋白表達(dá)量持續(xù)增加(P<0.05)(圖1B)。

A：Western blot PAGE電泳圖；B：蛋白電泳灰度值定量統(tǒng)計(jì)圖：與GV組比較，*P<0.05；與GVBD組比較，#P<0.05；與MⅠ組比較，▲P<0.05。圖1 小鼠卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟過程中CDK1蛋白的變化

二、小鼠卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟過程中CDK1 mRNA的表達(dá)

分別收集50～100個(gè)GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母細(xì)胞，采用qRT-PCR分析CDK1 mRNA表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參。CDK1 mRNA在GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期均有表達(dá)；與GV期比較，GVBD期和MⅠ期CDK1 mRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.05)，而MⅡ期CDK1 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)(圖2)。

A：qRT-PCR產(chǎn)物電泳圖；B：CDK1 mRNA相對定量統(tǒng)計(jì)圖：與GV組比較，*P<0.05；與GVBD組比較，#P<0.05；與MⅠ組比較，▲P<0.05。圖2 小鼠卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟過程中CDK1 mRNA的表達(dá)

三、小鼠卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟過程中CDK1蛋白及其mRNA表達(dá)的相關(guān)性

采用Spearman相關(guān)分析確定CDK1蛋白與mRNA變化的相關(guān)性。結(jié)果表明，小鼠卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟過程中CDK1蛋白表達(dá)與CDK1 mRNA表達(dá)相關(guān)性較差(R=0.200，P=0.800，圖3)。

圖3 小鼠卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟過程中CDK1蛋白和mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析

討 論

體外受精周期的未成熟卵母細(xì)胞較多可能影響受精及胚胎發(fā)育潛能，導(dǎo)致可供移植的胚胎數(shù)減少[11]，妊娠率下降[12]。而哺乳動物卵母細(xì)胞的成熟是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程[13]。未成熟的卵母細(xì)胞不具備受精能力，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈ψ銐驍?shù)量的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，特別是CDK1[14]。在牛GV期卵母細(xì)胞生長過程中，其CDK1蛋白逐漸積累[15]。CDK1蛋白含量限制了山羊GV期卵母細(xì)胞減數(shù)分裂能力的獲得[16]。青春期前山羊GV期卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)27 h后其CDK1蛋白表達(dá)增加[17]。Chesnel等[18]的研究表明，小鼠體內(nèi)卵母細(xì)胞生長到有能力完成GVBD的時(shí)候p34cdc2(CDK1)的合成和積累增加。而不管卵母細(xì)胞是否具備減數(shù)分裂能力，CDK1 mRNA的濃度都沒有明顯變化[7，14]。但現(xiàn)有研究幾乎都局限于體外培養(yǎng)的或從不同大小卵泡液中獲取的卵母細(xì)胞。目前尚無卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟不同時(shí)期CDK1表達(dá)情況的相關(guān)報(bào)道。

本研究從促排卵小鼠體內(nèi)分別收集GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母細(xì)胞，Western blot結(jié)果表明，在GV期向GVBD轉(zhuǎn)變過程中CDK1蛋白表達(dá)增加了近1倍，在GVBD向MⅠ期轉(zhuǎn)變過程中CDK1蛋白表達(dá)增加了30%左右。而de Vant’ery等[19]通過Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)小鼠GV期卵母細(xì)胞在體外發(fā)生GVBD后CDK1蛋白含量增加了4倍左右，這可能是體外培養(yǎng)上調(diào)了GV期向GVBD轉(zhuǎn)化過程中卵母細(xì)胞CDK1蛋白表達(dá)譜。本研究通過qRT-PCR分析顯示GV期向GVBD轉(zhuǎn)變過程中CDK1 mRNA表達(dá)下調(diào)約20%，在GVBD向MⅠ期轉(zhuǎn)變過程中CDK1 mRNA表達(dá)繼續(xù)下調(diào)了近1倍，這與Firmani等[14]的體外研究結(jié)論不相符，也許是因?yàn)槟壳绑w外培養(yǎng)條件尚不能完全模擬體內(nèi)環(huán)境，體外成熟改變了卵母細(xì)胞成熟相關(guān)的CDK1 mRNA的表達(dá)譜。由此，我們推測體內(nèi)卵母細(xì)胞從GV期到GVBD、GVBD到MⅠ期轉(zhuǎn)變過程中CDK1蛋白表達(dá)的增加并不是mRNA的表達(dá)量增加引起的，可能是由于其它機(jī)制使得mRNA翻譯效率提高所致。本研究結(jié)果還顯示，從MⅠ到MⅡ期，卵母細(xì)胞CDK1蛋白表達(dá)增加了近50%，CDK1 mRNA表達(dá)增加了4倍多，且MⅡ期卵母細(xì)胞的CDK1蛋白和mRNA的積累量達(dá)到最大值，這表明小鼠卵母細(xì)胞在MⅡ期儲存了足夠的母源CDK1 mRNA和蛋白質(zhì)，為維持卵母細(xì)胞早期卵裂期胚胎的正常發(fā)育提供了保障[20]。

進(jìn)一步的Spearman相關(guān)分析表明，小鼠卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟過程中CDK1蛋白與其mRNA表達(dá)相關(guān)性較差，因此可見卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟過程中CDK1蛋白的增加并不完全是由轉(zhuǎn)錄水平的變化引起的，我們推測在轉(zhuǎn)錄后水平上可能還有其他機(jī)制影響CDK1蛋白的翻譯。但還需要進(jìn)行廣泛而深入的研究，這對闡明人胚胎發(fā)育特征以及認(rèn)識不孕不育等疾病發(fā)病機(jī)制具有一定的參考意義。