鄒玥，劉穎

(吉林省婦幼保健院中心實驗室，長春 130000)

多囊卵巢綜合征(PCOS)多出現(xiàn)無排卵性不孕，是一種生殖內分泌紊亂性疾病，臨床多表現(xiàn)為卵巢多囊性改變、月經(jīng)失調、高雄激素血癥和持續(xù)性排卵障礙等，其病理特征主要是性激素分泌紊亂、胰島素抵抗[1]。雌、孕激素是影響子宮內膜生長發(fā)育、維持正常月經(jīng)周期的重要性激素[2]。目前臨床大多以補充外源性雌、孕激素來改善PCOS患者月經(jīng)失調、不孕等癥狀[3]；但其作用的有效靶點尚不明確，尋找雌、孕激素作用的內源性靶點可能為PCOS的臨床診療提供新的思路和參考。

微小RNAs(miRNAs)作為內源性小分子單鏈RNA，由19～24個核苷酸構成，參與人體內分泌、代謝、生長發(fā)育以及多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，并且其數(shù)量和種類也隨疾病狀況和生理狀況而改變[4]。研究發(fā)現(xiàn)，卵母細胞發(fā)育與miR-320a表達水平顯著相關，而miR-145可以通過調控巨噬細胞的增殖和凋亡，在胚胎著床過程中發(fā)揮免疫耐受作用[5-6]，二者均可能與PCOS具有一定關系。目前，尚未有研究報道PCOS患者血清miR-320a、miR-145的表達情況，及其與PCOS患者雌孕激素水平是否相關。因此，本研究擬采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測PCOS患者血清miR-320a、miR-145的表達水平，并分析其與雌孕激素的關系，以期為臨床治療提供參考和借鑒。

資料與方法

一、研究對象

采用前瞻性研究，選取2019年5月至2021年7月于本院就診的92例PCOS患者作為PCOS組，另招募同期在本院健康體檢的90例育齡期女性作為對照組。

納入標準：(1)年齡≥20歲；(2)對照組經(jīng)B超檢查卵巢形態(tài)正常，排除PCOS；(3)PCOS組符合PCOS的診斷標準[7]；(4)患者均簽訂知情同意書。

排除標準：(1)合并子宮肌瘤、卵巢囊腫等生殖器官器質性疾?。?2)合并糖尿病等內分泌疾病或自身免疫性疾??；(3)合并惡性腫瘤及嚴重臟器功能障礙；(4)合并精神障礙；(5)近6個月內使用過激素類藥物。

二、研究方法

1.樣本采集：抽取空腹靜脈血6 ml(對月經(jīng)不規(guī)律者于B超檢查未見優(yōu)勢卵泡時抽取肘靜脈血，對于月經(jīng)規(guī)律者在月經(jīng)周期3～5 d抽取肘靜脈血)，靜置2 h后放入離心機，以3 500 rpm離心5 min，吸取上層血清，將其均勻分為兩份，置于離心管中，放入-80℃冰箱中保存。

2.Real-time PCR：使用Trizol試劑盒(Invitrogen，美國)提取血清中總RNA，用cDNA合成試劑盒(北京天根)進行反轉錄，最后采用Real-time PCR法檢測血清miR-320a和miR-145相對表達量。miR-320a采用定量PCR試劑盒(FP411，Cell Signaling Technology，美國)進行Real-time PCR反應，反應條件：95℃ 15 min，94℃ 20 s，65℃ 30 s，72℃ 34 s，5個循環(huán)，94℃ 20 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)。miR-145亦采用定量PCR試劑盒(FP401，北京天根)進行Real-time PCR反應，反應條件：94℃ 10 min，94℃ 15 s、60℃ 30 s，45個循環(huán)，72℃ 5 min。均以U6為內參。采用2-ΔΔCt計算miR-320a和miR-145相對表達情況。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR反應引物序列

3.雌孕激素檢測：采用電化學發(fā)光法進行檢測，使用全自動化學發(fā)光儀(Cobas e411，羅氏，德國)檢測血清E2、孕酮水平，檢測中所需的試劑盒均由德國羅氏公司提供。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、兩組患者的臨床資料比較

兩組患者的年齡和體質量指數(shù)(BMI)比較均無顯著性差異(P>0.05)；電化學發(fā)光法檢測結果顯示，PCOS組患者血清E2和孕酮水平均顯著低于對照組(P<0.05)(表2)。

表2 兩組患者臨床資料比較[(-±s)，M(Q1，Q3)]

二、兩組患者血清miR-320a、miR-145表達水平比較

Real-time PCR結果顯示，PCOS組血清miR-320a和miR-145表達水平均顯著低于對照組(P<0.05)(圖1)。

與對照組比較，*P<0.05。圖1 兩組患者血清miR-320a和miR-145表達水平比較

三、PCOS患者血清miR-320a、miR-145表達水平與雌孕激素水平的相關性分析

Pearson相關分析結果顯示，PCOS患者血清miR-320a、miR-145表達與E2和孕酮水平均呈顯著性正相關(P<0.05)(表3，圖2、3)。

表3 PCOS患者血清miR-320a、miR-145表達水平與E2、孕酮水平的相關性分析

A：血清miR-320a與E2的相關性分析；B：血清miR-320a與孕酮的相關性分析。圖2 血清miR-320a與E2、孕酮的相關性分析

A：血清miR-145與E2相關性分析；B：血清miR-145與孕酮相關性分析。圖3 血清miR-145與E2、孕酮相關性分析

討 論

隨著人民生活方式的轉變和生活壓力的增加，女性PCOS發(fā)病率為5%～21%，并呈現(xiàn)上升趨勢[8]。PCOS患者多伴有閉經(jīng)、不孕、多毛及肥胖等癥狀，增加了并發(fā)心血管疾病和2型糖尿病的風險，嚴重者甚至出現(xiàn)自然流產(chǎn)現(xiàn)象，影響患者的遠期健康及生育問題[9]，故需引起臨床的高度重視。PCOS的發(fā)生與非酒精性脂肪肝病、環(huán)境因素、血脂異常、代謝綜合征及遺傳等有關，但PCOS的具體病因或發(fā)病機制尚未明確，且徹底治愈較難。目前，藥物治療是PCOS患者臨床治療的首選方式，通過外源性激素調節(jié)體內雌、孕激素水平，雖然能在一定程度上改善臨床癥狀，但并未能從根本上解決問題，且易引發(fā)患者代謝紊亂[10]。因此，亟需尋找可以調節(jié)雌、孕激素的內在靶點，以期為治療PCOS提供新方向。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，PCOS患者血清miR-320a、miR-145表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，推測miR-320a、miR-145可能參與PCOS的病理過程。PCOS患者月經(jīng)周期不穩(wěn)定以及不孕的重要因素是卵泡生長受抑制導致其發(fā)育異常。miRANs是內源性非編碼小分子RNA，作為轉錄后調控的關鍵因子，其可以調控多種生物過程，并參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。miR-320a具有抗炎、調控細胞增殖和抗氧化的作用，其表達水平與卵母細胞發(fā)育情況聯(lián)系密切。既往研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者外周血miR-320a表達水平顯著低于正常女性[11]，本研究結果與之相符。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-320a通過直接靶向SF-1和E2F-1調節(jié)卵巢顆粒細胞增殖，維持卵泡生長發(fā)育，miR-320a與PCOS的發(fā)生密切相關[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者血清miR-145可以通過激活細胞外信號調節(jié)激酶來抑制顆粒細胞的增殖，促進細胞凋亡進而參與PCOS的發(fā)生發(fā)展；與對照組比較，PCOS患者血清miR-145表達水平呈現(xiàn)顯著下降的趨勢[13]。此外，胰島素受體底物(IRSI)作為miR-145的靶基因，其蛋白表達受到miR-145的抑制，進而miR-145抑制了PCOS患者顆粒細胞的增殖。

本研究結果顯示，PCOS患者血清孕酮和E2水平均顯著低于對照組(P<0.05)，說明PCOS患者雌激素、孕激素均低于健康育齡女性。雌孕激素作為影響子宮內膜的重要因素之一，在其發(fā)揮調控作用后，會引起子宮內膜出現(xiàn)周期性變化，從而形成月經(jīng)周期(規(guī)律的月經(jīng)出現(xiàn)是生殖功能成熟的標志)[14]。E2作為由卵泡分泌的一種雌激素，可以促進下丘腦-垂體系統(tǒng)促性腺激素釋放激素-垂體促性腺激素(GnRH-Gn)表達，發(fā)揮正反饋作用，進而促進排卵[15]，而PCOS患者由于下丘腦-垂體-卵巢軸功能異常，故E2水平也較低。另外，E2可以刺激輸卵管的發(fā)育及蠕動，促進卵母細胞或受精卵著床。此外，雌激素還可以間接反應卵母細胞的質量，而卵母細胞的質量則影響卵母細胞體外成熟，并影響PCOS患者生育及妊娠結局[16]。孕激素是由人體卵巢顆粒黃體細胞分泌產(chǎn)生，主要以孕酮為代表，作為一種天然孕激素，它是妊娠維持所必須的激素，具有抑制排卵，促進子宮內膜分泌的作用[17]。PCOS是一種常與無排卵相關的異質性疾病，由于PCOS患者成熟卵泡發(fā)育少，無法排卵，導致雌激素保持在低水平的閾值范圍，并且卵巢不能分泌孕激素，因此PCOS患者雌孕激素水平較低，子宮內膜發(fā)育遲緩，導致正常月經(jīng)周期和早期妊娠不能維持，影響生育。

Pearson相關性分析顯示，PCOS患者血清miR-320a、miR-145表達與E2和孕酮水平均呈顯著正相關(P<0.05)，提示臨床干預中可通過靶向調控miR-320a、miR-145的表達來調節(jié)PCOS患者雌孕激素水平，為臨床治療PCOS患者提供新方向。雌激素局部合成的主要場所是顆粒細胞，可以對卵泡的生長產(chǎn)生刺激，并給其它組織提供內分泌信號[18]。相關研究發(fā)現(xiàn)，miR-320a靶向作用于轉錄因子E2F1和SF-A，促進顆粒細胞增殖，促進雌激素合成以及孕酮產(chǎn)生[19]。miR-145參與炎癥和免疫過程，以及細胞的分化、代謝、凋亡等，并在其中發(fā)揮重要作用，同時對IRS1具有靶向抑制作用，進而起到抑制細胞增殖的效果。另外，miR-145可以通過顆粒細胞中的P13K/AKT信號通路，使細胞代謝中的胰島素水平得到調節(jié)，促使PCOS患者E2和孕酮表達水平升高。

綜上所述，PCOS患者血清miR-320a、miR-145的表達水平顯著低于正常育齡期女性，且血清miR-320a、miR-145表達水平與血清E2、孕酮水平呈正相關，提示臨床干預中可通過調控miR-320a、miR-145的表達來調節(jié)PCOS患者雌孕激素水平。但是，由于本研究納入的樣本量較少，研究結果可能存在一定的局限性，后續(xù)研究仍需進一步擴大樣本量加以驗證，以期為臨床干預提供一定參考和依據(jù)。