鄒薇，蔣夢(mèng)芬，馬天仲

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湛江 524001)

輔助生殖技術(shù)(ART)是指采用醫(yī)療輔助手段使得不孕不育夫婦妊娠的技術(shù)[1]。雖然ART所涉及的各項(xiàng)技術(shù)不斷優(yōu)化完善，但現(xiàn)有的ART并不能完全滿足所有不孕不育患者生育健康后代的希望，另外該項(xiàng)技術(shù)仍存在一定安全隱患[2]。研究發(fā)現(xiàn)ART子代出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育受損和心臟代謝功能受損的風(fēng)險(xiǎn)增加[3]，自然流產(chǎn)和印記障礙等不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)也增加[4]。此外，ART顯著增加了妊娠期和圍產(chǎn)期并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)[5-6]，特別是妊娠期高血壓疾病的風(fēng)險(xiǎn)[7]。

胎盤是印記基因高表達(dá)的器官。迄今為止，在人類基因組中發(fā)現(xiàn)了100多個(gè)印記基因，其中75個(gè)在胎盤中表達(dá)，許多印記基因已被證實(shí)參與了胎兒和胎盤的發(fā)育調(diào)節(jié)作用[8-10]。胎盤容易受到各種因素的影響，ART在體外的醫(yī)源性操作過程中可能干擾子代基因的表達(dá)，進(jìn)而改變胎盤結(jié)構(gòu)和功能，影響胎盤母體向胎兒供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)，對(duì)母體和胎兒均造成損傷，導(dǎo)致許多不良的妊娠結(jié)局，危害母胎健康[11]。因此通過文獻(xiàn)調(diào)研，本課題選擇了與ART子代胎盤生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)的胎盤生長(zhǎng)因子(placental growth factor，PIGF)和印記基因父系表達(dá)基因3(paternally expressed gene 3，PEG3)進(jìn)行研究，通過檢測(cè)分析PIGF和PEG3在ART妊娠及自然妊娠胎盤中的基因、蛋白表達(dá)水平的差異，探討ART對(duì)PIGF和PEG3的影響以及對(duì)誘發(fā)妊娠不良結(jié)局的相關(guān)影響，進(jìn)一步評(píng)估ART的安全性。

資料和方法

一、研究對(duì)象

收集2021年9—12月在廣東醫(yī)科大學(xué)順德婦女兒童醫(yī)院產(chǎn)科分娩的產(chǎn)婦臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)產(chǎn)婦年齡<35周歲；(2)單胎妊娠；(3)新生兒檢查無畸形且無明顯出生缺陷；(4)夫妻雙方染色體正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：產(chǎn)婦孕前合并嚴(yán)重的內(nèi)外科并發(fā)癥(如嚴(yán)重的心臟病、高血壓病、糖尿病、甲狀腺疾病等)。

根據(jù)妊娠方式不同分為自然妊娠組和ART組，兩組進(jìn)行年齡、產(chǎn)前體質(zhì)量指數(shù)(BMI)配對(duì)消除偏移，最終納入ART組113例，自然妊娠組153例。兩組各隨機(jī)收集18例胎盤，分組標(biāo)記為自然妊娠組(A1-A18)，ART組(B1-B18)。兩組孕婦均簽署知情同意書，本研究經(jīng)廣東醫(yī)科大學(xué)順德婦女兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒、Real Time PCR System反應(yīng)體系(Takara，寶日醫(yī)藥生物，日本)；TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(南京諾唯贊生物)；PEG3、PIGF、GAPDH引物(上海生工生物工程公司)；過氧化物酶、抗鼠/兔IgG聚合物(北京中杉金橋)；山羊血清工作液(北京博奧森生物)；PEG3兔抗體(Affinity Biosciences，美國(guó))；PIGF兔抗體(Proteintech，美國(guó))；GAPDH兔抗體(上海碧云天)，PageRulerTM預(yù)染蛋白marker26616(Thermo Scientific，美國(guó))、Genstart預(yù)染蛋白marker221(上海起發(fā))。

ABI7500熒光定量PCR儀(Thermo Fisher，美國(guó))；組織切片機(jī)RM2235(LEICA，德國(guó))、OLYMPUS DP71顯微照相系統(tǒng)(OLYMPUS，日本)、ReadMax1200型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(上海閃譜生物)。

三、研究方法

1.標(biāo)本采集：胎盤娩出后，在無菌操作下收集胎盤，并立即予以稱重。剪取胎盤母體面邊緣處的胎盤組織，大小為3 cm×3 cm×3 cm，避開鈣化區(qū)，去除母體蛻膜層，將胎盤絨毛浸于常溫生理鹽水中清洗血跡，分裝成2份，一份保存于10%中性福爾馬林固定液中，另一份保存于無菌凍存管中，并在30 min內(nèi)轉(zhuǎn)移至-80°超低溫冰箱中。

2.qRT-PCR檢測(cè)PIGF和PEG3的mRNA表達(dá)水平：用Trizol法抽提總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA，選擇TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(Code No. RR820A/B)進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)。PCR引物由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)并合成，各引物序列見表1。反應(yīng)體系為10 μl：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)5.0 μl、PCR Forward Primer(10 μmol/L) 0.4 μl、PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μl、ROX Reference Dye or Dye Ⅱ(50×)0.2 μl、RT反應(yīng)液(cDNA溶液)1.0 μl及dH2O 3.0 μl。反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，退火&延伸60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。操作過程均在冰上進(jìn)行。采用SYBR Green與雙鏈DNA結(jié)合的嵌合熒光檢測(cè)法，用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。

表1 PEG3、PIGF和GAPDH引物序列

3.免疫組化分析PIGF和PEG3蛋白定位：胎盤組織常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，隨后脫蠟水化，用枸櫞酸緩沖液抗原修復(fù)，滴加試劑1(過氧化物酶)與試劑2(山羊血清工作液，稀釋10倍)封閉，加入一抗工作液(PEG3 1∶200，PIGF 1∶600)，陰性對(duì)照為PBS溶液，4℃過夜孵育。加入二抗(抗鼠/兔IgG聚合物50 μl)，配制DAB顯色工作液，蘇木素復(fù)染核，梯度乙醇脫水透化，最后樹膠封片拍片。

4.Western blot檢測(cè)胎盤中PIGF和PEG3蛋白的表達(dá)水平：用RIPA裂解液提取胎盤組織蛋白后，樣品分裝2管試管，一管蛋白樣品用BCA法測(cè)定蛋白濃度，另一管蛋白樣品用Loading Buffer變性，不同標(biāo)本按照具體蛋白濃度進(jìn)行上樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫下放置搖床封閉1～2 h，加入一抗(稀釋度1∶1 000)4℃孵育過夜，TBST溶液洗膜3次，每次5 min，后加入二抗(稀釋度1∶300)孵育60 min，洗膜后Tanon5200成像系統(tǒng)顯影。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、兩組產(chǎn)婦一般資料比較

與自然妊娠組相比，ART組產(chǎn)婦的年齡、BMI、剖宮產(chǎn)比例均顯著上升(P<0.05)，而產(chǎn)次顯著下降(P<0.05)；ART組的分娩孕周亦顯著低于自然妊娠組(P<0.05)(表2)。

表2 兩組產(chǎn)婦的一般資料比較[(-±s)，n(%)]

二、兩組產(chǎn)婦的妊娠并發(fā)癥比較

與自然妊娠組相比，ART組產(chǎn)婦的妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病(GDM)發(fā)生率均顯著升高(P<0.05)；兩組產(chǎn)婦間的胎兒生長(zhǎng)受限、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥、胎膜早破、羊水過少和前置胎盤發(fā)生率均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 兩組產(chǎn)婦妊娠并發(fā)癥比較[n(%)]

三、兩組新生兒基本情況比較

與自然妊娠組新生兒相比，ART組的新生兒早產(chǎn)、低出生體重兒率顯著升高，出生孕周顯著下降(P均<0.05)；兩組間新生兒出生體重?zé)o顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 兩組新生兒基本情況比較[(-±s)，n(%)]

四、兩組產(chǎn)婦胎盤組織中PEG3和PIGF的mRNA表達(dá)水平比較

qRT-PCR結(jié)果顯示，ART組產(chǎn)婦胎盤組織中PIGF的mRNA表達(dá)水平顯著低于自然妊娠組(P<0.05)，而PEG3的mRNA表達(dá)水平在兩組間無顯著性差異(P>0.05)(表5)。

表5 兩組產(chǎn)婦PEG3和PIGF mRNA表達(dá)水平比較(-±s)

五、兩組胎盤組織中PEG3和PIGF蛋白表達(dá)的定位

HE染色結(jié)果顯示，ART組胎盤和自然妊娠組胎盤光鏡下大體結(jié)構(gòu)正常，均存在典型的絨毛結(jié)構(gòu)(箭頭所示)，胎盤血管豐富，胎盤無明顯鈣化及水腫(圖1)。

兩組均可見典型的絨毛結(jié)構(gòu)(箭頭所示)，血管豐富，胎盤無明顯鈣化及水腫。圖1 兩組胎盤組織的HE染色結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示，PEG3蛋白主要表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜中(圖2)，而PIGF蛋白主要表達(dá)于胎盤的合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中(箭頭所示)(圖3)。蛋白光密度測(cè)定結(jié)果顯示，ART組胎盤組織中PEG3蛋白的光密度值顯著低于自然妊娠組[(0.221±0.061)vs. (0.309±0.069)](P<0.05)，而PIGF蛋白的光密度值在兩組之間無顯著性差異[(0.217±0.079)vs. (0.245±0.069)](P>0.05)(圖4)。

PEG3主要表達(dá)于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜中(箭頭所示)。圖2 兩組胎盤組織中PEG3的免疫組化結(jié)果

PIGF主要表達(dá)于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中(箭頭所示)。圖3 兩組胎盤組織中PIGF的免疫組化結(jié)果

圖4 兩組胎盤組織中PIGF和PEG3蛋白的光密度值比較

六、兩組胎盤組織PEG3和PIGF蛋白的表達(dá)水平

Western blot結(jié)果顯示，PIGF和PEG3蛋白在ART組胎盤組織中的表達(dá)水平較自然妊娠組呈下調(diào)趨勢(shì)(圖5)。蛋白灰度值測(cè)定結(jié)果顯示，ART組胎盤組織中的PEG3蛋白灰度值顯著低于自然妊娠組[(0.154±0.633) vs. (1.203±1.380)](P<0.05)，而PIGF蛋白的灰度值有低于自然妊娠組的趨勢(shì)[(0.443±0.234) vs. (0.786±0.353)]，但差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表6)。

圖5 兩組胎盤組織中PEG3和PIGF蛋白的Western blot條帶

表6 兩組胎盤組織中PIGF、PEG3蛋白灰度值比較

討 論

文獻(xiàn)表明，與自然妊娠相比，ART中新鮮胚胎移植會(huì)增加子代早產(chǎn)、低出生體重兒的風(fēng)險(xiǎn)[12-13]，凍融胚胎移植會(huì)增加巨大兒的風(fēng)險(xiǎn)[14]，ICSI會(huì)增加子代出生缺陷和低劣的精液質(zhì)量轉(zhuǎn)移到男性后代的風(fēng)險(xiǎn)[15]。體外受精與GDM、妊娠期高血壓疾病、子癇前期、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥、前置胎盤、胎盤早剝、胎膜早破、早產(chǎn)、低出生體重的發(fā)生率以及剖宮產(chǎn)率顯著增加相關(guān)[16]。ART發(fā)生多胎妊娠和不良圍產(chǎn)期結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)明顯更高，包括早產(chǎn)、低出生體重和出生缺陷[17]。ART醫(yī)源性體外操作可能導(dǎo)致妊娠期并發(fā)癥及子代健康風(fēng)險(xiǎn)增加，具體機(jī)制尚未明確，本課題目標(biāo)之一是探討ART與孕產(chǎn)婦和新生兒結(jié)局之間的關(guān)系，與自然妊娠的結(jié)果進(jìn)行比較，確定ART是否顯著增加不良妊娠結(jié)局的發(fā)生率，并研究其與具體并發(fā)癥之間的相關(guān)性。采用t檢驗(yàn)的方法對(duì)入組受試者的妊娠期并發(fā)癥、圍產(chǎn)期并發(fā)癥和新生兒結(jié)局進(jìn)行研究和分析。

本研究中，首先比較了ART組和自然妊娠組產(chǎn)婦的一般資料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)ART的孕婦在沒有手術(shù)指征的情況下選擇了剖宮產(chǎn)。入組時(shí)已經(jīng)剔除高齡孕婦可能對(duì)此結(jié)果造成的影響，而后進(jìn)一步比較ART組和自然妊娠組的分娩方式和剖宮產(chǎn)醫(yī)學(xué)指征，數(shù)據(jù)顯示ART組中68.1%的婦女接受了剖宮產(chǎn)，其中大部分是擇期剖宮產(chǎn)，ART顯著增加了剖宮產(chǎn)的發(fā)生，這可能與ART孕婦經(jīng)過多重障礙妊娠，孕育的子代更為珍貴有關(guān)，故人為選擇剖宮產(chǎn)的比例提升。但也有研究表明ART與剖宮產(chǎn)的發(fā)生無直接關(guān)系[18]，ART是否導(dǎo)致剖宮產(chǎn)率增加還有待進(jìn)一步研究。

有文獻(xiàn)報(bào)道，ART的單胎妊娠比自然妊娠中的單胎妊娠發(fā)生妊娠期高血壓、子癇前期、GDM、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥、產(chǎn)后出血、早產(chǎn)、低出生體重的風(fēng)險(xiǎn)增加[19-20]。本研究統(tǒng)計(jì)分析得出，ART可能與妊娠期高血壓、GDM的發(fā)生率顯著升高有關(guān)，與新生兒結(jié)局不良的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道[19-20]一致；但是對(duì)胎兒生長(zhǎng)受限、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥、胎膜早破、羊水過少和前置胎盤等的發(fā)生無明顯影響，考慮與本研究存在一些不足之處有關(guān)，如納入樣本量較少、醫(yī)院選擇較為單一，后期可以開展不同地區(qū)不同醫(yī)院的大樣本多中心研究來進(jìn)一步驗(yàn)證。

本課題探討了PIGF和印記基因PEG3在ART妊娠和自然妊娠胎盤中的表達(dá)差異情況。結(jié)果顯示，ART組胎盤中與妊娠期不良結(jié)局密切相關(guān)的PIGF mRNA表達(dá)下調(diào)，與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的印記基因PEG3表達(dá)處于低水平狀態(tài)。PIGF和PEG3在兩組胎盤中mRNA與蛋白表達(dá)趨勢(shì)一致，均是ART組的表達(dá)低于正常妊娠組，但ART組PEG3的mRNA表達(dá)水平和PIGF蛋白水平雖有低表達(dá)趨勢(shì)，但是差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這可能與本實(shí)驗(yàn)樣本量小有關(guān)，后期可加大樣本量繼續(xù)研究。

綜上所述，通過ART助孕的產(chǎn)婦，孕期發(fā)生妊娠期高血壓和GDM的幾率增加，新生兒不良結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)亦增加；ART助孕影響胎盤組織中PIGF和PEG3 mRNA及蛋白水平的表達(dá)，但是不影響胎盤結(jié)構(gòu)，ART助孕對(duì)胎盤的影響還需要進(jìn)一步研究。