吳淑娟，覃曉琳，陳嬌，楊菁

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 湖北省輔助生殖與胚胎發(fā)育醫(yī)學(xué)臨床研究中心，武漢 430060)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)是指與同一性伴侶發(fā)生兩到三次連續(xù)或不連續(xù)的妊娠24周前的流產(chǎn)[1]，除常見的解剖、遺傳、內(nèi)分泌、免疫因素及感染、血栓前狀態(tài)等病因[2]外，還有約一半的患者原因不明[3]。在這些不明原因RSA患者中，母胎界面免疫微環(huán)境失調(diào)可能是其潛在的原因之一[4]。巨噬細(xì)胞約占母胎免疫屏障細(xì)胞構(gòu)成的20%[5]，大量研究表明，M1和M2巨噬細(xì)胞極化失衡與母體對(duì)胎兒的免疫耐受息息相關(guān)。M1為經(jīng)典激活細(xì)胞，主要分泌促炎細(xì)胞因子；M2為交替激活細(xì)胞，表達(dá)抗炎標(biāo)志物[6]。環(huán)境或自身某些因素的改變引起巨噬細(xì)胞由M2向M1轉(zhuǎn)變，這時(shí)母體炎癥因子浸潤，不利于妊娠的繼續(xù)維持[7]。所以，巨噬細(xì)胞的極化可能決定了妊娠的最終結(jié)局。

Rho相關(guān)激酶1(ROCK1)是Rho亞家族最重要的效應(yīng)分子之一，通過調(diào)控肌動(dòng)蛋白調(diào)控細(xì)胞的形態(tài)、極性、細(xì)胞骨架重構(gòu)和細(xì)胞遷移等。有學(xué)者利用U937細(xì)胞系，研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞極化可能依賴于Rho/ROCK通路[8]。有研究表明，RhoA/ROCK通過核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥發(fā)生，從而影響糖尿病腎病的發(fā)展[9]。而ROCK1是否在M1巨噬細(xì)胞極化過程中發(fā)揮作用及其可能的作用機(jī)制尚未見報(bào)導(dǎo)。因此，本文主要討論ROCK1對(duì)巨噬細(xì)胞向M1極化的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.細(xì)胞系：巨噬細(xì)胞系THP1細(xì)胞，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

2.主要試劑和儀器：兔抗人ROCK1抗體(武漢三鷹)；小鼠抗人β-肌動(dòng)蛋白(β-actin，上海體艾比瑪特)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco，美國)；佛波酯(PMA，Sigma，美國)；干擾素-γ(IFN-γ)、脂多糖(LPS)(Peprotech，美國)；PerCP/Cyanine5.5標(biāo)記小鼠抗人CD86抗體(Biolegend，美國)；活性氧檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白上樣緩沖液(上海碧云天)；RNAex Pro Reagent試劑(長沙艾科瑞)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒(南京諾唯贊)；ROCK1抑制劑Y27632(MCE，美國)；電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)(BIO-RAD，美國)；qPCR儀(Roche，瑞士)；普通光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)。

二、研究方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)及實(shí)驗(yàn)分組：THP1細(xì)胞系在添加10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素(武漢賽維爾)的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長，然后放置于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。將懸浮的THP1細(xì)胞接種于6孔板中，以每孔100 ng/ml終濃度的PMA誘導(dǎo)48 h細(xì)胞貼壁，分化為M0巨噬細(xì)胞。向M0細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加IFN-γ 20 ng/ml、LPS 100 ng/ml繼續(xù)誘導(dǎo)48 h設(shè)為M1組；向M0細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加IFN-γ 20 ng/ml、LPS 100 ng/ml、ROCK1抑制劑Y27632 1 μmol/L繼續(xù)誘導(dǎo)48 h設(shè)為M1+Y27632組；添加等量的PBS 48 h設(shè)為對(duì)照M0組。

2.RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)：使用RNAex Pro Reagent試劑盒按照說明書的步驟提取巨噬細(xì)胞總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒在Bio-Rad PCR儀上將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，cDNA稀釋6倍后，利用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR試劑在Roche RT-PCR系統(tǒng)上進(jìn)行qRT-PCR，檢測(cè)促炎因子白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、單核細(xì)胞趨化性蛋白1(MCP1)、CXC趨化因子配體16(CXCL16)和ROCK1的mRNA表達(dá)水平。PCR擴(kuò)增條件：95℃ 60 s，95℃ 10 s，60℃ 30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)?；虮磉_(dá)定量采用2-ΔΔCt法計(jì)算，選擇GAPDH作為內(nèi)參基因，計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。所用引物由武漢擎科公司合成，序列見表1。

表1 引物序列表

3.蛋白提取及Western blot檢測(cè)：使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸化蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液從巨噬細(xì)胞中提取總蛋白，冰上裂解20 min，超聲充分裂解細(xì)胞，12 000g4℃離心5 min，上清即為所提取的蛋白液。用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。隨后加入1/4體積的5×上樣緩沖液，95℃孵育10 min。取約30 μg蛋白在SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳并轉(zhuǎn)移到0.45 μm PVDF膜上。然后將該膜置入無蛋白快速封閉液(上海雅酶)在室溫下孵育10 min，隨后與兔抗人ROCK1抗體(1∶1 000)或小鼠抗人β-actin抗體(1∶5 000)4℃下孵育過夜。PVDF膜用緩沖鹽水(武漢賽維爾)和0.1% Tween 20(TBST)洗滌3次，每次10 min，然后用HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。隨后用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描成像，觀察相應(yīng)蛋白表達(dá)情況。

4. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD86的表達(dá)：將細(xì)胞用胰蛋白酶(北京biosharp)消化下來，PBS洗滌1次，1 000g離心5 min，用200 μl PBS重懸細(xì)胞沉淀，每孔加入5 μl PerCP/Cyanine5.5標(biāo)記小鼠抗人CD86抗體，4℃孵育30 min。用PBS洗滌2次，300 μl PBS重懸后流式細(xì)胞儀檢測(cè)。細(xì)胞用Beckman流式細(xì)胞儀(Cytoflex LX，美國)進(jìn)行收集，每個(gè)樣本約分析10 000個(gè)細(xì)胞。數(shù)據(jù)用FlowJo(Version 10.6.2)軟件進(jìn)行分析。

5. 細(xì)胞活性氧(ROS)水平檢測(cè)：采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平進(jìn)行檢測(cè)，用無血清的培養(yǎng)基以1∶1 000稀釋ROS試劑盒中的DCFH-DA探針制備工作液，細(xì)胞消化離心后用工作液重懸，37℃孵育30 min，無血清培養(yǎng)基洗滌3次，200 μl PBS重懸后用Beckman流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、THP1來源巨噬細(xì)胞向M1極化過程中細(xì)胞形態(tài)、IL-6、CXCL16和ROCK1 mRNA和蛋白表達(dá)變化

與對(duì)照M0組相比，M1組細(xì)胞伸出更多偽足(圖1A)；qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照M0組相比，M1組細(xì)胞IL-6和CXCL16的mRNA水平顯著增加(P<0.05)(圖1B、C)，提示M1巨噬細(xì)胞極化成功；Western blot和qRT-PCR結(jié)果表明，與對(duì)照M0組相比，M1組細(xì)胞中ROCK1的蛋白和mRNA水平均顯著增加(P<0.05)(圖1D、E)，由此推測(cè)ROCK1可能與M1巨噬細(xì)胞的極化有關(guān)。

A：細(xì)胞形態(tài)圖；B：IL-6 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)；C：CXCL16 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)；D：ROCK1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)；E：ROCK1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)；與對(duì)照M0組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 M1極化過程中巨噬細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)、mRNA和蛋白表達(dá)變化

二、抑制ROCK1對(duì)促炎因子表達(dá)水平變化的影響

繼續(xù)檢測(cè)添加ROCK1抑制劑Y27632后各組中促炎因子表達(dá)水平的變化。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照M0組相比，M1組中促炎因子IL-6、TNF-α、MCP-1、CXCL16的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與M1組相比，M1+Y27632組IL-6、TNF-α、MCP-1、CXCL16的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)(圖2)。以上結(jié)果表明抑制ROCK1能抑制M1巨噬細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。

A：CXCL16 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)；B：IL6 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)；C：MCP 1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)；D：TNF-α mRNA表達(dá)水平檢測(cè)；與M1組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 抑制ROCK1對(duì)促炎因子表達(dá)水平變化的影響

三、抑制ROCK1對(duì)M1巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物變化的影響

用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組中M1巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照M0組相比，M1組中CD86陽性細(xì)胞的比例顯著升高(P<0.01)；與M1組相比，M1+Y27632組CD86陽性細(xì)胞的比例顯著降低(P<0.05)(圖3)。結(jié)果提示，ROCK1與M1巨噬細(xì)胞的極化有關(guān)，抑制ROCK1能抑制M1巨噬細(xì)胞的極化。

A：細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86陽性細(xì)胞流式檢測(cè)圖；B：CD86陽性細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)圖；與M1組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 抑制ROCK1對(duì)M1巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物變化的影響

四、抑制ROCK1后細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化

用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果顯示，當(dāng)向M1極化時(shí)，M1組細(xì)胞內(nèi)的ROS水平較對(duì)照M0組顯著上升(P<0.01)；與M1組比較，M1+Y27632組ROS的水平顯著降低(P<0.01)(圖4)。提示ROCK1可能通過調(diào)節(jié)ROS水平參與巨噬細(xì)胞向M1的極化。

A：ROS流式細(xì)胞檢測(cè)圖；B：ROS平均熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖；與M1組比較，**P<0.01。圖4 抑制ROCK1后細(xì)胞內(nèi)ROS的水平變化

討 論

大量研究證實(shí)，蛻膜中M1巨噬細(xì)胞減少，使得M2巨噬細(xì)胞占據(jù)主要地位，發(fā)揮抗炎作用得以維持正常妊娠[10]。而在異常妊娠和RSA中，女性的M1巨噬細(xì)胞水平顯著高于正常妊娠[11]。由于巨噬細(xì)胞在妊娠中起非常關(guān)鍵的作用，因此尋找巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制，既有助于我們更充分認(rèn)識(shí)RSA的發(fā)病過程，也為治療RSA尋找新靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。

ROCK1是Rho亞家族最重要的效應(yīng)分子之一，主要調(diào)控細(xì)胞的形態(tài)、極性、細(xì)胞骨架重構(gòu)和細(xì)胞遷移等。關(guān)于ROCK1的研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域，沉默或者敲低ROCK1基因能抑制非小細(xì)胞肺癌、鼻咽癌、乳腺癌等的侵襲和轉(zhuǎn)移[12-14]。有研究報(bào)道沉默ROCK1基因能抑制巨噬細(xì)胞的NLRP3信號(hào)傳導(dǎo)，從而改善呼吸機(jī)誘導(dǎo)的小鼠肺損傷[15]。而ROCK1如何調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的M1極化卻未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ROCK1與THP1衍生的巨噬細(xì)胞M1極化相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)在LPS和IFN-γ所誘導(dǎo)的M1極化過程中，ROCK1的表達(dá)顯著升高。于是我們使用ROCK1的功能抑制劑Y27632探究ROCK1對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用。與M0巨噬細(xì)胞相比，M1巨噬細(xì)胞中的促炎因子IL-6、TNF-α、MCP1、CXCL16的mRNA表達(dá)水平均顯著升高，表面標(biāo)志物CD86陽性的細(xì)胞比例也顯著增加；給予Y27632之后，IL-6、TNF-α、MCP1、CXCL16的mRNA表達(dá)水平較M1組顯著降低，CD86陽性細(xì)胞比例也顯著降低(P<0.05)，這提示抑制ROCK1之后抑制了M1巨噬細(xì)胞的極化。有研究報(bào)道，ROCK1在氯化鈷誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細(xì)胞衍生的微粒(MP)中表達(dá)升高，參與先兆子癇的發(fā)?。籖OCK1蛋白可能參與正常妊娠的維持并與細(xì)胞的氧化應(yīng)激相關(guān)[16]。同時(shí)由于ROS是激活炎性通路的重要介質(zhì)，高水平的ROS通過表觀遺傳重編程促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞的極化[17]。我們檢測(cè)了3組細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，激活的M1巨噬細(xì)胞表達(dá)高水平的ROS，抑制ROCK1之后則逆轉(zhuǎn)了這一改變。這表明ROCK1能調(diào)控ROS的水平，激活炎癥通路促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞極化。但是我們并沒有進(jìn)一步探究抑制ROCK1之后炎癥信號(hào)通路的變化，如NF-κB、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1、6(STAT1、STAT6)等，這是本研究的局限性之一。后續(xù)我們將繼續(xù)研究ROCK1對(duì)巨噬細(xì)胞M1極化信號(hào)通路的調(diào)節(jié)以及M1巨噬細(xì)胞內(nèi)的代謝改變，并嘗試探討ROCK1對(duì)M2巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控和相關(guān)的機(jī)制，以期為預(yù)防或干預(yù)RSA中巨噬細(xì)胞的M1/M2極化失衡提供新的思路和參考。