勞艷萍，姚妮，唐秀法，公方強，黃華，牛向麗

(廣西壯族自治區(qū)生殖醫(yī)院，南寧 530000)

出生性別比(Sex ratio at birth，SRB)的平衡對于維持社會穩(wěn)定、促進經(jīng)濟發(fā)展具有重要意義，性別比例的嚴重失衡可能引發(fā)一系列社會問題。SRB以每出生100個女嬰對應出生男嬰數(shù)表示。第一性別比(Primary sex ratio，PSR)是指懷孕時的男女性別比例。有數(shù)據(jù)表明，自然妊娠的PSR為107～170∶100[1]，其會因為自然流產(chǎn)或性別選擇等因素顯著降低。SRB是監(jiān)測人口生殖健康簡單又無創(chuàng)的一種方式[2]。傳統(tǒng)的自然妊娠男女嬰兒的出生比例為106～110.2∶100[3]。我國不孕不育發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，2007年我國的不孕率約為12%，2010年不孕率上升至15%，2020年不孕率上升至18%左右。輔助生殖技術(shù)(ART)幫助很多不孕癥患者實現(xiàn)成功受孕，我國每年ART總周期數(shù)在100萬以上，出生嬰兒數(shù)超過30萬[4]。隨著大量試管嬰兒的出生，會不會影響SRB？引起性別比例失衡？以上這些問題都有待驗證。因此，本研究回顧性分析2010年1月至2019年12月在我院行體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)治療并成功妊娠分娩共19 844個周期患者的臨床資料，排除由患者個人因素如年齡、男方體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、女方BMI、不孕類型、職業(yè)等因素造成SRB改變的干擾因素，單純從實驗室因素(受精方式、移植胚胎類型、移植胚胎時期和移植胚胎數(shù))分析ART對子代SRB的影響。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2010年1月至2019年12月在我院行IVF/ICSI-ET并成功妊娠分娩的共19 844個周期患者的臨床資料。

納入標準：在電子病例系統(tǒng)中明確含有受精方式、移植胚胎類型、移植胚胎時期和移植胚胎數(shù)信息；移植<3枚胚胎；獲得成功妊娠并分娩。

排除標準：受精方式、移植胚胎類型、移植胚胎時期和移植胚胎數(shù)其中任一項信息不明確。

二、研究方法

1.分組：由于受精方式、移植胚胎類型、移植胚胎時期和移植胚胎數(shù)目等是ART的主要實驗室因素，因此，根據(jù)不同受精方式分為IVF組(n=14 626)和ICSI組(n=4 908)(剔除行補救ICSI的310個周期)；根據(jù)不同移植胚胎時期分為卵裂胚組(n=8 778)和囊胚組(n=11 066)；根據(jù)不同移植胚胎類型分為新鮮胚胎組(n=11 533)和解凍胚胎組(n=8 311)；根據(jù)不同移植胚胎個數(shù)分為單胚胎組(移植1枚胚胎，n=3 871)和雙胚胎組(移植兩枚胚胎，n=14 483)(剔除移植≥3枚胚胎的1 490個周期)。

2.促排卵方案：依據(jù)患者情況采用長方案、短方案、超長方案、微刺激方案、拮抗劑方案、自然周期等促排卵方案，均按照常規(guī)操作進行[5]。

3.胚胎冷凍和解凍復蘇：行胚胎冷凍者采用玻璃化冷凍及解凍復蘇[6]；使用玻璃化冷凍解凍試劑盒(KITAZATO，加藤，日本)，早上解凍，當天中午或者下午移植。

4.胚胎質(zhì)量評價：D3胚胎移植一般選擇優(yōu)質(zhì)胚胎，如無優(yōu)質(zhì)胚胎，則在患者知情同意的情況下選擇非優(yōu)質(zhì)胚胎移植。采用Peter評分法[7]對卵裂期胚胎進行評分；正常受精胚胎中評1～2級、6細胞及6細胞以上的胚胎和提前進入融合期的胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。囊胚評級采用Gardner評分法[8]，根據(jù)囊胚腔大小和是否孵出分為1～6期，根據(jù)內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞數(shù)目分為A、B、C三級；優(yōu)先移植3期及以上非CC級囊胚，若無3期及以上囊胚，可移植1、2期囊胚。

5. 胚胎移植：<35歲患者第1次移植周期移植2枚卵裂期胚胎或1枚囊胚，若無優(yōu)質(zhì)囊胚形成可移植2枚囊胚；如第1次移植未孕，再次移植時可移植2枚胚胎。≥35歲患者可移植2枚胚胎。患者有剖宮產(chǎn)史或子宮肌壁間肌瘤剔除術(shù)后且年齡<40歲，第1、2次移植建議移植1枚胚胎，若無優(yōu)質(zhì)胚胎則告知多胎妊娠風險并簽字后可移植2枚胚胎；移植2次優(yōu)胚均未孕時，告知多胎妊娠風險并簽字后可移植2枚胚胎；年齡≥40歲患者，告知多胎妊娠風險并簽字后可移植2枚胚胎。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料用率(%)表示，組間比較采用卡方檢驗；采用單因素以及多因素Logistic回歸分析各因素與SRB的相關性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、IVF/ICSI-ET總體新生兒的SRB情況

我院2010年1月至2019年12月行IVF/ICSI-ET出生的新生兒共24 661名，其中男嬰占54.9%(13 532/24 661)，女嬰占45.1%(11 129/24 661)，該時期ART的SRB(121.6∶100)高于文獻報道的自然受孕的SRB(106～110.2∶100)。新鮮胚胎移植出生的男嬰為7 941名，女嬰6 655名，新鮮胚胎移植出生的新生兒占ART出生總新生兒的59.2%(14 596/24 661)；解凍胚胎移植出生的男嬰5 591名，女嬰4 474名，解凍胚胎移植出生的嬰兒占比為40.8%(10 065/24 661)。除去補救ICSI出生的嬰兒，行IVF出生的男嬰為10 172名，女嬰為8 059名，行IVF出生的新生兒占比為73.9%(18 231/24 661)；行ICSI出生的男嬰為3 135名，女嬰為2 915名，行ICSI出生的新生兒占比為24.5%(6 050/24 661)。移植卵裂胚出生的男嬰為5 829名，女嬰為5 168名，移植卵裂胚出生的新生兒占比為44.6%(10 997/24 661)；移植囊胚出生的男嬰為7 703名，女嬰為5 961名，移植囊胚出生的新生兒占比為55.4%(13 664/24 661)。單胚胎移植出生的男嬰為2 229名，女嬰為1 715名，單胚胎移植出生的新生兒占比為16.0%(3 944/24 661)；雙胚胎移植出生的男嬰為10 264名，女嬰為8 519名，雙胚胎移植出生的新生兒占比為76.2%(18 783/24 661)。

二、IVF/ICSI-ET中不同實驗室因素對SRB的影響

IVF/ICSI-ET的實驗室因素包括：受精方式、移植胚胎類型、移植胚胎時期和移植胚胎數(shù)。

1.受精方式對SRB的影響：根據(jù)不同受精方式分為IVF組(n=14 626)和ICSI組(n=4 908)。IVF組共出生10 172名男嬰，8 059名女嬰，SRB為126.2∶100；ICSI組共出生3 135名男嬰，2 915名女嬰，SRB為107.5∶100；IVF組SRB顯著高于ICSI組(P<0.05)。對這兩組患者根據(jù)移植胚胎時期和胚胎類型進行亞組分層，在相同移植時期或相同胚胎類型的分層中，IVF組SRB均顯著高于ICSI組(P<0.05)(表1)。

表1 不同受精方式對SRB的影響(%)

2.移植胚胎時期對SRB的影響：根據(jù)不同移植胚胎時期分為卵裂胚組(n=8 778)和囊胚組(n=11 066)。卵裂胚組的SRB(112.8∶100)顯著低于囊胚組(129.2∶100)(P<0.05)。對這兩組患者根據(jù)不同受精方式和胚胎類型進行亞組分層，在相同受精方式或胚胎類型的分層中，囊胚組的SRB均顯著高于卵裂期組(P<0.05)(表2)。

表2 不同移植胚胎時期對SRB的影響(%)

3.移植胚胎類型對SRB的影響：根據(jù)不同移植胚胎類型分為新鮮胚胎組(n=11 533)和解凍胚胎組(n=8 311)。新鮮胚胎組的SRB為119.3∶100，解凍胚胎組的SRB為125.0∶100，解凍胚胎組的SRB略高于新鮮胚胎組，但差異尚無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表3)。

表3 不同移植胚胎類型對SRB的影響(%)

4.移植胚胎數(shù)對SRB的影響：根據(jù)不同移植胚胎數(shù)分為單胚胎組(n=3 871)和雙胚胎組(n=14 483)。單胚胎組的SRB(130.0∶100)顯著高于雙胚胎組(120.5∶100)(P<0.05)；但是，根據(jù)不同移植時期進行亞組分層比較時，兩組間SRB未表現(xiàn)出顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 不同移植胚胎數(shù)對SRB的影響(%)

三、單因素和多因素Logistic回歸分析不同影響因素和SRB的相關性

單因素和多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，受精方式[OR=0.854，95%CI(0.803，0.908)]和移植胚胎時期[OR=1.192，95%CI(1.114，1.276)]是SRB的獨立影響因素(P<0.001)(表5)。

表5 單因素和多因素Logistic回歸分析不同影響因素與SRB的相關性

四、2010～2019年我院總SRB變化趨勢

2010～2019年我院IVF/ICSI-ET周期出生新生兒的總SRB變化趨勢如下：SRB沒有明顯逐年升高或者降低的趨勢；在相同年份中，卵裂胚的SRB相對于囊胚有降低的趨勢，ICSI的SRB相對于IVF有降低的趨勢(表6)。

表6 2010～2019年我院總SRB變化趨勢

討 論

從全國人口第7次普查數(shù)據(jù)得知，男性人口為72 334萬人，占51.24%(72 334/141 178)；女性人口68 844萬人，占48.76%(68 844/141 178)，全國總?cè)丝谛詣e比為105.07∶100[9]。性別比偏高的直接原因就是SRB偏高，受到曾經(jīng)重男輕女思想的影響，SRB曾一路攀高，2000年曾經(jīng)達到118.6∶100，2010年也停留在118.1∶100，個別省份個別年份的性別比甚至高達125∶100甚至130∶100以上。在針對SRB偏高的干預措施下，2010年后我國SRB開始明顯下降，2020年降到111.3∶100[10]。目前，總?cè)丝谥心行员扰远? 490萬，造成的婚姻擠壓是客觀存在的，SRB失衡會影響經(jīng)濟發(fā)展和社會和諧。許多生物因素、環(huán)境因素會影響自然受孕的SRB，父母年齡較大、母親體重較高、高壓力(社會因素、戰(zhàn)爭、地震、經(jīng)濟困境)和有害物質(zhì)接觸(吸煙、污染物、殺蟲劑)等會降低SRB[11-12]。此外，在正常的人類發(fā)育過程中，有一種性別偏向的死亡率趨勢，孕期女性胎兒的死亡率總體較高，這被認為是由于母體遺傳的mRNA或胚胎合成的RNA表達中斷所致[13]。另一種理論是，父親的X染色體在一定程度上阻礙了發(fā)育，從而增加了女性胎兒死亡率[14]。這兩種理論說明了孕期女性胎兒死亡率的升高會導致SRB升高。

本研究發(fā)現(xiàn)，IVF/ICSI-ET總體新生兒SRB為121.6∶100，稍高于我國2010年的SRB 118.1∶100，高于之前文獻報道的自然妊娠SRB(106～110.2∶100)[3]。南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心2008～2014年ART出生嬰兒的SRB為116∶100[15]。廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院2013～2014年ART的平均SRB為118∶100[16]。由以推測，ART相比于自然妊娠可能會增加男嬰的出生比。

以往諸多研究發(fā)現(xiàn)，IVF較ICSI會增加男嬰出生比[1，12，15，17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，行IVF受精出生的新生兒SRB為126.2∶100，高于傳統(tǒng)自然妊娠SRB(106～110.2∶100)。張力佳等[15]和王麗等[18]研究報道，行IVF受精出生的新生兒SRB分別為124∶100和128∶100，與我中心的數(shù)據(jù)相近。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，行ICSI出生的新生兒SRB(107.5∶100)與自然妊娠SRB相近。李磊等[16]研究發(fā)現(xiàn)，行ICSI受精出生的新生兒SRB為105∶100，我中心數(shù)據(jù)與之相近。根據(jù)移植胚胎時期或胚胎類型進行亞組分析，在相同移植胚胎時期或胚胎類型的分層中，IVF組SRB顯著高于ICSI組(P<0.05)。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，受精方式[OR=0.854，95%CI(0.803，0.908)]可能是SRB的獨立影響因素。Supramaniam等[1]統(tǒng)計分析英國1 376 454個治療周期得出，IVF相比于ICSI會增加16%的男嬰出生；受精方式對SRB的影響在調(diào)整女性年齡、移植胚胎時期后仍有統(tǒng)計學意義。Bu等[12]分析了中國18個生殖中心共121 247名新生嬰兒，IVF組的SRB顯著高于ICSI組(P<0.05)。

Tarín等[19]的一項Meta分析結(jié)果顯示，IVF受精的PSR在129～150∶100之間，ICSI受精的PSR為107∶100。男性射精時含有相同比例的X、Y精子[20]，然而IVF在受精后雄性胚胎比例遠遠高于雌性胚胎。受精方式的差異主要是對X和Y精子的選擇傾向性不同造成的。有學者認為，ICSI主要取決于操作者，一般選擇ICSI的大多是由于男方因素導致的不育，Y精子形態(tài)異常多，操作者傾向于找形態(tài)正常的精子，因此X精子更容易被選中[16]。而行IVF時，男性胚胎在受精后可能比女性胚胎有發(fā)育優(yōu)勢，透明帶的分子組成可能使卵母細胞更容易被攜帶Y染色體的精子受精，Y精子可能具有較高的受精能力[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，密度梯度法有利于Y精子的富集，增加Y精子的比例，因此，密度梯度法會增加男嬰的出生[21]。普通的ICSI(非手術(shù)取精)和IVF都會用到密度梯度法處理，手術(shù)取精的ICSI采用直接離心法處理。為了區(qū)分精液處理方法的不同，李磊等[16]將ICSI分為普通ICSI和經(jīng)皮附睪、睪丸穿刺取精術(shù)結(jié)合ICSI技術(shù)(PESA/TESA-ICSI)，普通ICSI的SRB(113∶100)與IVF的SRB(121∶100)比較無顯著差異(P>0.05)，PESA/TESA-ICSI的SRB(92∶100)顯著低于IVF的SRB(121∶100)(P<0.05)，提示精子的優(yōu)選方法對SRB影響較大。

以往的研究證明，囊胚移植會增加ART中男嬰的出生比例[17，19，22-23]。本研究結(jié)果顯示，移植囊胚的新生兒SRB(129.2∶100)顯著高于卵裂胚移植的新生兒(112.8∶100)(P<0.05)。Chang等[24]的一項Meta分析結(jié)果顯示，囊胚移植出生男嬰是卵裂期胚胎移植的1.29倍，本研究結(jié)果與之相似。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，移植胚胎時期[OR=1.192，95%CI(1.114，1.276)]可能是SRB的獨立影響因素(P<0.001)。丁錦麗等[25]的Meta分析結(jié)果顯示，囊胚移植組的SRB顯著高于卵裂期胚胎移植組，且不受時間和地域的影響(P<0.001)。以往很多研究移植囊胚的SRB與自然妊娠相比偏高，李磊等[16]研究發(fā)現(xiàn)，囊胚移植組的SRB為138∶100，IVF囊胚移植組的SRB為146∶100。田莉峰等[23]研究報道，解凍囊胚移植的SRB為142∶100。劉帥等[26]研究發(fā)現(xiàn)，解凍IVF囊胚移植的SRB為142.6∶100。以上結(jié)果表明，囊胚移植對性別平衡的影響值得引起重視。

囊胚移植SRB偏高的原因可能有以下幾點：首先，在人類胚胎早期發(fā)育中男性胚胎的發(fā)育速度明顯高于女性胚胎，自受精后第2天開始，男性胚胎發(fā)育速度較女性胚胎至少提前4.5 h且獲得最高形態(tài)學評分的胚胎中72%為男性胚胎[27-28]。在挑選胚胎移植時，通常選擇發(fā)育良好、形態(tài)符合移植標準的胚胎進行移植，因此，男性胚胎被選為優(yōu)質(zhì)囊胚進行移植的概率很大[29-30]。Gutiérrez-Adán等[31]研究發(fā)現(xiàn)，X染色體上存在6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)和抗氧化酶次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)，這兩個基因可以調(diào)控糖代謝和氧化應激，女性胚胎比男性胚胎多1條X染色體，G6PD的雙倍效應使得女性胚胎需要攝取更多的葡萄糖；HPRT的雙倍效應則使女性胚胎中更多的氧自由基被清除，過多的氧自由基對細胞有傷害作用，但適量的氧自由基則有利于細胞的生長。因此，G6PD和HPRT的雙倍效應不利于女性胚胎應對體外培養(yǎng)環(huán)境的壓力，最終導致其生長速度要慢于男性胚胎[29]。其次，由于男性胚胎比女性胚胎能更快地吸收丙酮酸和葡萄糖，從而更快地實現(xiàn)囊胚期的發(fā)育[22]。再者，囊胚移植后出現(xiàn)更高的繼發(fā)性性別比例可能是由于植入后早期女性胚胎優(yōu)先死亡所致，至少部分是由于兩條X染色體中的1條異常失活(劑量補償機制)導致[32]；另外，Gutiérrez-Adán等[31]研究發(fā)現(xiàn)，與IVF比較，ICSI操作過程可致女性胚胎X染色體更早失活，從而使ICSI組女性胚胎體外培養(yǎng)時發(fā)育滯后的現(xiàn)象不明顯。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，解凍胚胎移植的SRB(125.0∶100)略高于新鮮移植(119.3∶100)，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，移植胚胎類型對SRB無顯著影響。Bu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，解凍胚胎移植可以提高SRB，但Logistic回歸分析顯示解凍胚胎移植與SRB無顯著相關性，這可能與國內(nèi)大多數(shù)中心在解凍周期多采用囊胚移植，而囊胚移植是出生嬰兒性別比的獨立影響因素有關。有研究發(fā)現(xiàn)，解凍胚胎移植會增加女嬰的出生比例，分析原因可能與挑選移植和冷凍胚胎的標準有關，選擇形態(tài)、發(fā)育好的胚胎作為新鮮移植的標準，而冷凍發(fā)育相對較差的胚胎或囊胚[33-34]。本研究中的新鮮囊胚移植占29.2%(4 265/14 596)，解凍囊胚移植占93.3%(9 399/10 065)，本中心新鮮移植以卵裂胚為主，解凍移植以囊胚為主，因此解凍移植的SRB略高于新鮮移植，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。不同胚胎類型對SRB的影響跟每個中心的移植策略有關，移植囊胚越多其SRB值就會升高。

本研究結(jié)果顯示，單胚胎移植的SRB顯著高于雙胚胎移植(P<0.05)。但是，Logistic回歸分析顯示，移植胚胎數(shù)與SRB無顯著相關性。單胚胎移植中囊胚移植占85.6%(3 376/3 944)，雙胚胎移植中囊胚移植占54.7%(10 280/18 783)，而囊胚移植可能會增加ART中男嬰的出生比例，因此，單胚胎移植囊胚占比大可能是單胚胎移植SRB顯著高于雙胚胎移植的原因。孫文楓等[17]研究發(fā)現(xiàn)，移植1、2、3枚胚胎的SRB分別為119.4∶100、114∶100及107∶100，可以看出隨著移植胚胎數(shù)量的增加SRB有下降趨勢，與我們的研究結(jié)果相符。本研究發(fā)現(xiàn)，移植1枚卵裂期胚胎的SRB略低于移植2枚卵裂期胚胎，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而移植單囊胚的SRB略高于移植雙囊胚(P>0.05)，提示移植胚胎數(shù)對SRB的影響會受到不同移植胚胎時期的影響。

隨著培養(yǎng)液和培養(yǎng)系統(tǒng)的不斷改進、實驗室人員操作技術(shù)的不斷優(yōu)化、胚胎體外培養(yǎng)環(huán)境不斷改良，這些因素的變化是否會對SRB造成影響？為解答上述問題，本研究統(tǒng)計了2010～2019年我院總SRB的變化趨勢發(fā)現(xiàn)，SRB沒有明顯逐年升高或者降低的趨勢；同年份中，卵裂胚移植的SRB低于囊胚移植，ICSI的SRB低于IVF。同一中心近些年若是提高了囊胚移植的比例或者提倡單囊胚移植，SRB就可能有升高的趨勢。

綜上所述，ART可能會增加男嬰的出生，行IVF助孕或移植囊胚可能會增加SRB。為了最大程度減少對出生比例平衡的影響，我們可以試著改變精液處理的方法，提高移植卵裂期胚胎的比例，控制性別比，防止性別比失衡，促進ART的健康發(fā)展。