孫 晗

(莆田學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，福建 莆田 351100)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一種以血糖升高為特征的慢性多基因遺傳病，可歸因于遺傳和環(huán)境危險(xiǎn)因素的相互作用[1]。我國最新成人T2DM總體患病率為11.6%，患者的數(shù)量也位居世界第一[2]。轉(zhuǎn)錄因子7類似物2基因(transcription Factor 7-Like 2,TCF7L2)是一種高度可變的轉(zhuǎn)錄因子，在胰腺β細(xì)胞[3]中發(fā)揮著調(diào)節(jié)胰島素分泌和維持血糖穩(wěn)態(tài)的重要作用。目前已有大量的研究證實(shí)TCF7L2單核苷酸基因多態(tài)性(single nucleotide polymorphism， SNP)與T2DM易感性顯著相關(guān)，且存在地域、民族、人種的差異性[4]。目前我國人群關(guān)于TCF7L2基因的rs7903146多態(tài)性與T2DM遺傳易感性的研究結(jié)果不盡一致，福建省尚缺乏對TCF7L2基因的rs7903146多態(tài)性研究。同時，吸煙作為T2DM發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素之一已經(jīng)被廣泛認(rèn)同[5]，吸煙量與T2DM風(fēng)險(xiǎn)之間存在劑量反應(yīng)關(guān)系。本研究旨在探討福建漢族人群TCF7L2基因的多態(tài)性與T2DM的遺傳易感性的關(guān)系，以及基因—環(huán)境交互作用對于T2DM發(fā)病的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019—2021年莆田學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科住院及體檢的受試者100人，互無親緣關(guān)系，隨機(jī)分組：T2DM組52人，其中，男性28人，女性24人，平均年齡(48.52±12.75)歲；NC組48人，其中，男性26人，女性22人，平均年齡(45.23±13.24)歲。T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2022年美國糖尿病協(xié)會(The American Diabetes Association,ADA)的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，包括口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test， OGTT) ≥11.1 mmol/L和/或空腹血糖(fasting blood-glucose,FPG)≥ 7.0 mmol/L，或既往已確診為T2DM患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除患有1型糖尿病、酮癥酸中毒、慢性肝腎功能不全、結(jié)核及惡性腫瘤的患者。本研究符合赫爾辛基宣言，經(jīng)莆田學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得所有受試者的書面同意。

1.2 研究方法及檢測指標(biāo)

由經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的調(diào)查員進(jìn)行健康問卷調(diào)查并測量受試者的身高、體重，身高精確到0.1cm，體重精確到0.1kg，并計(jì)算體質(zhì)指數(shù)(body mass index,BMI)。禁食8～10小時后，次晨采集靜脈血檢測糖化血紅蛋白(Hemoglobin A1c,HbA1c)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-c)、甘油三酯(triglyceride,TG)、空腹胰島素(fasting insulin,FINS)、FPG，并留取2mL置于EDTA管在-20℃冰箱保存，同時，計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素β細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-β)。HOMA-β指數(shù)計(jì)算公式為：20×FINS/(FPG-3.5)。使用自動生化分析儀(7100；日立，日本東京)，血清胰島素采用免疫熒光法檢測(TOOH全自動酶免疫分析儀AIA-2000ST)，所有血清生化分析均在莆田學(xué)院附屬醫(yī)院完成。

1.3 基因組DNA提取和SNP分型

研究對象取全血600μL和細(xì)胞裂解液CL(天根生化科技,RK151-02)1000μL；去上清，加200μL緩沖液GS(天根生化科技,RK152-02)；加20μL蛋白酶K(武漢禾元生物科技股份有限公司， HYC032R01.1)；加200μL緩沖液GB(天根生化科技,RK115-01)；加200μL無水乙醇(上海聯(lián)邁生物工程有限公司，LM64-17-5)，并轉(zhuǎn)移至CB3吸附柱中；先后加入500μL緩沖液GD (天根生化科技,RK118-01)，700 μL漂洗液PW，500μL 漂洗液PW (天根生化科技,RK113-01)；CB3放于收集管中，CB3轉(zhuǎn)移到離心管，滴加100μL洗脫緩沖液TB(天根生化科技,RK153-02)，將離心管中溶液收集，即提取得基因組DNA 溶液。利用美國國立衛(wèi)生院SNP數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)查詢SNP的序列，設(shè)計(jì)引物和探針。引物序列上游5’-ACAATTAGAGAGCTAAGCACTTTTTAGGTA-3’,下游5’-GTGAAGTGCCCAAGCTTCTC‐3’。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction， PCR)回收液進(jìn)行直接基因測序。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s ，58 ℃退火10 s， 72 ℃ 延伸40 s ，40個循環(huán)，72 ℃ 最后延伸7 min。采用Taqman探針法，PCR反應(yīng)和基因分型都在ABI 7500 Real Time PCR儀器(ABI公司，美國)上進(jìn)行，用該儀器的自帶軟件包對PCR程序進(jìn)行設(shè)置，熒光信號讀取同時對基因進(jìn)行自動分型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組人群一般資料比較

兩組人群的性別比例、年齡、BMI、TC、吸煙人數(shù)比例沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性(P>0.05)。T2DM組的HbA1c、LDL-c、TG、FINS、FPG顯著高于NC組(P<0.05)見表1。

表1 兩組人群一般資料比較

2.2 兩組人群TCF7L2基因型和等位基因分布

兩組受試者基因頻率分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)，具有群體代表性。所有受試者中未檢測出TT型。T2DM組中CC型頻率為73.1%，CT型基因頻率為26.9%；在NC組中CC型頻率為89.6%，CT型基因頻率為10.4%；經(jīng)卡方檢驗(yàn)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2值=4.419，P=0.036)，OR(95%CI)=3.168(1.044～9.618)。C等位基因的頻率分別為86.5%和94.8%，T等位基因的頻率分別為13.5%和5.2%，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值=0.047，P=0.047)，OR(95%CI)=2.831(0.979～8.187)(P<0.05)見表2。

表2 兩組人群TCF7L2基因rs7903146

2.3 不同基因型的一般資料比較

所有受試者中，按C/T基因型分為CT組和CC組。CT組的人群在性別、BMI、HbA1c、FINS、FPG、吸煙人數(shù)、HOMA-β相較CC組人群沒有顯著差異(P>0.05)見表3。

表3 rs7903146基因型的一般資料比較

2.4 TCF7L2基因rs7903146多態(tài)性與吸煙的相關(guān)分析

將受試者根據(jù)基因型與吸煙情況分為：CC未吸煙組、CC吸煙組、CT未吸煙組以及CT吸煙組；運(yùn)用單因素Logistic回歸分析檢驗(yàn)不同基因型與吸煙之間的交互作用，在調(diào)整了性別、年齡、BMI、TG、TC、LDL-c等因素后，結(jié)果表明，與CC未吸煙組相比，CC吸煙組、CT未吸煙組及CT吸煙組發(fā)生T2DM的風(fēng)險(xiǎn)增加依次為28.1%，OR(95%CI)=1.281(1.016～1.432)；41.7%，OR(95%CI)=1.417(1.043～2.601)及85.2%，OR(95%CI)=1.852(1.133～3.420)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)見表4。

表4 TCF7L2基因rs7903146多態(tài)性與吸煙的相關(guān)分析

3 討論

T2DM是以胰島素抵抗和胰島素分受損為主要特征的慢性復(fù)雜性疾病，其原因尚未明確，可能是基因和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果有關(guān)。此前的全基因組研究表明，TCF7L2的表達(dá)與胰島素的分泌功能相關(guān)[7]。TCF7L2基因位于染色體10q25.3上長度為216.86 KB，是Wnt信號通路的成員之一，在胚胎細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，該通路與胰島素分泌密切相關(guān)[8]。此外，TCF7L2基因還參與通過Wnt信號修飾胰島素和胰高血糖素蛋白的表達(dá)，已有研究證明了胰腺β細(xì)胞中TCF7L2的高表達(dá)與葡萄糖代謝之間的顯著關(guān)聯(lián)[3]。

2006年，Grant[9]首次報(bào)道了冰島人群中TCF7L2基因的兩個SNPs位點(diǎn)(rs12255372和rs7903146)與T2DM 的發(fā)病顯著相關(guān)。后來的研究[10]也證實(shí)，TCF7L2基因rs7903146變異型是目前和T2DM發(fā)病關(guān)聯(lián)的最強(qiáng)基因型。然而，中國人群的TCF7L2的基因多態(tài)性與T2DM的遺傳易感性在國內(nèi)不同地區(qū)、民族存在異質(zhì)性。王志強(qiáng)[11]認(rèn)為，TCF7L2基因的rs7903146位點(diǎn)可能與新疆維吾爾族人群2型糖尿病的發(fā)生相關(guān)。焦倩[12]報(bào)道在黑龍江省漢族人群中rs7903146的C/T多態(tài)性與T2DM有相關(guān)性且與胰島素抵抗相關(guān);馮秋萍[13]發(fā)現(xiàn)在內(nèi)蒙古地區(qū)漢族人群，攜帶突變等位基因T可增加罹患T2DM的風(fēng)險(xiǎn)。然而在鄭曉雅[14]及劉國政[15]的報(bào)道中，未發(fā)現(xiàn)rs7903146位點(diǎn)的多態(tài)性與T2DM的發(fā)病相關(guān)。

在本次研究中，攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位基因的CT基因型人群患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型人群的3.168倍(P<0.05)。在T2DM組中，風(fēng)險(xiǎn)等位基因T的頻率為13.5%，顯著高于NC組的5.2%。攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位基因T的人群患T2DM的風(fēng)險(xiǎn)是等位基因C的2.831倍(P<0.05)，這也與已有研究結(jié)果相符。本次研究結(jié)果表明，rs7903146位點(diǎn)的多態(tài)性與福建漢族人群的T2DM發(fā)病顯著相關(guān)。但其T等位基因頻率低于吳貽竟[16]報(bào)道的河南地區(qū)漢族人群的20.2%及維吾爾族人群[11]的30.2%；高于鄭曉雅[14]報(bào)道的重慶地區(qū)漢族人群T2DM組T等位基因頻率10.6%。說明TCF7L2基因rs7903146多態(tài)性在中國呈現(xiàn)出地區(qū)、民族的異質(zhì)性。但是本研究中，CC基因型和CT基因型人群FINS、HOMA-β指數(shù)沒有顯著差異(P>0.05)，因此尚未能觀察到攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位基因T的人群出現(xiàn)胰島功能下降的現(xiàn)象。

已有研究表明[5]，吸煙者比非吸煙者發(fā)生糖尿病的概率增加30%～40%，這可能與吸煙介導(dǎo)的肥胖和炎癥反應(yīng)引起的胰島素抵抗相關(guān)，吸煙是T2DM重要環(huán)境暴露因素之一。運(yùn)用單因素Logistic回歸分析不同基因型與吸煙的交互作用發(fā)現(xiàn)，與CC基因型未吸煙組人群相比，CC基因型吸煙組、CT基因型未吸煙組及CT基因型吸煙組發(fā)生糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)增加依次為28.1%、41.7%及85.2%(P<0.05)。研究結(jié)果表明，攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位基因T與吸煙同為T2DM的危險(xiǎn)因素，TCF7L2基因rs7903146基因多態(tài)性與吸煙具有交互作用，可增加T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，TCF7L2中rs7903146的基因多態(tài)性與T2DM的發(fā)病相關(guān)，攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位基因T是T2DM的危險(xiǎn)因素之一，其多態(tài)性與吸煙之間存在基因—環(huán)境的交互作用，增加福建漢族人群T2DM易感性。