郭春燕，姚 琨，聶存喜，紀(jì)守坤，嚴(yán) 慧，李勝利*，張文舉*

（1.晉中職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，山西榆次 030600；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市生鮮乳質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，北京 100193；3.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071000）

植物乳桿菌是乳酸菌的一種，外形呈圓短直桿菌，屬于革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌。研究表明，植物乳桿菌可促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收[1]、具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用[2-3]、對(duì)致病菌有抑制作用[4-5]、緩解乳糖不耐癥[6]、抑制腫瘤細(xì)胞的形成[7-8]等益生功能。植物乳桿菌對(duì)腸道微生物亦有著重要的影響[9-10]，主要通過(guò)活菌的積極生命活動(dòng)到達(dá)腸道來(lái)調(diào)節(jié)菌群平衡的，但益生菌產(chǎn)品的相關(guān)宣傳鮮少提及其通過(guò)消化道進(jìn)而在腸道定植成功的報(bào)道。因其執(zhí)行功能時(shí)必須耐受胃酸、膽鹽、消化酶等的不利因素[11-12]，對(duì)于反芻動(dòng)物來(lái)說(shuō)，還需要克服瘤胃微生物的分解作用，而益生菌微膠囊被視為解決這一問(wèn)題的有效技術(shù)。

本試驗(yàn)以植物乳桿菌JCM-1149 為囊芯物，采用丙烯酸樹脂和海藻酸鈉對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行雙層包被，分別對(duì)抗瘤胃微生物的降解和真胃胃酸的破壞[13-14]，促使更多菌體到達(dá)腸道靶向釋放；同時(shí)采用造瘺術(shù)（體內(nèi)驗(yàn)證法）對(duì)植物乳桿菌微囊化效果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期為益生菌在奶牛生產(chǎn)的科學(xué)應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 植物乳桿菌為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏的日系菌株JCM-1149，分離自泡菜；海藻酸鈉為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；聚丙烯酸樹脂為連云港康力特藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；微晶纖維素空白丸芯（直徑850～1 000 μm）為杭州高成生物營(yíng)養(yǎng)技術(shù)有限公司產(chǎn)品；多用途流化床試驗(yàn)機(jī)（WBF-1G，重慶英格造粒包衣技術(shù)有限公司）。

1.2 植物乳桿菌菌粉及膠囊制備

1.2.1 植物乳桿菌菌粉的制備 ①菌種的活化：將甘油管保存的植物乳桿菌JCM-1149 菌液添加到100 mL 三角瓶中，在34℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h；將培養(yǎng)好的菌液按2%的比例添加到500 mL 的搖瓶當(dāng)中，34℃靜置培養(yǎng)16 h。②擴(kuò)大培養(yǎng)：將上述搖瓶培養(yǎng)好的菌液倒入到200 L 發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。③收集菌泥：對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心處理，采用筒式離心機(jī)16 000 r/min，離心10 min，保留沉淀；對(duì)上清液再次離心，重復(fù)3 次，最后收集菌泥。④添加保護(hù)劑：用20% 脫脂奶粉作為保護(hù)劑，添加量為1～3 倍菌泥的重量。⑤冷凍干燥：先-20℃預(yù)凍4 h，再-80℃冷凍8 h，最后上冷凍干燥機(jī)抽真空制成菌粉。

1.2.2 植物乳桿菌微膠囊的制備 步驟①、②同1.2.1；③收集菌泥：對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心處理，采用筒式離心機(jī)16 000 r/min，離心10 min，收集菌泥。④制備菌泥混合液：取上述加工好的菌泥加入20% 脫脂奶粉水溶液（菌泥:20%脫脂奶粉溶液=1:3），充分混勻，即得加入保護(hù)劑的菌泥混合液。⑤制粒：以微晶纖維素空白丸芯（MCC）和海藻酸鈉充分混勻作為起膜芯粒；再加入上述菌泥混合液，最后上流化床進(jìn)行制粒。⑥包衣液的制備（海藻酸鈉和丙烯酸樹脂雙層包被）：一次包衣液的制備：配制含1.5%～2%的海藻酸鈉水溶液，所用溶劑為滅菌蒸餾水；二次包衣液的制備：配制含10～12%的丙烯酸樹脂水溶液，所用溶劑為滅菌蒸餾水。⑦流化床包衣：一次包衣采用頂噴包衣，包衣液為1.5%海藻酸鈉溶液，制粒后的顆粒用1.5%海藻酸鈉進(jìn)行包被。制粒顆粒在包衣前先在流化床干燥10 min，設(shè)置流化床試驗(yàn)機(jī)的進(jìn)風(fēng)量38～45 m3/h、流速12～18 r/min、霧化壓力1.2 kg/cm3、物料溫度（31±1）℃以及進(jìn)風(fēng)溫度75℃，整個(gè)包衣過(guò)程約耗時(shí)1～1.5 h。二次包衣：一次包衣結(jié)束后進(jìn)行二次頂噴包衣。一次包衣后的顆粒用12%丙烯酸樹脂進(jìn)行包被。設(shè)置流化床試驗(yàn)機(jī)的進(jìn)風(fēng)量55 m3/h、流速16 r/min、霧化壓力1.2 kg/cm3、物料溫度（31±1）℃以及進(jìn)風(fēng)溫度75℃，此次包衣過(guò)程約耗時(shí)10～15 min。

1.3 體外評(píng)價(jià) 配置人工胃液和腸液，進(jìn)行體外抗逆性評(píng)價(jià)，參照中國(guó)藥典進(jìn)行配置[15]。

1.4 體內(nèi)評(píng)價(jià)

1.4.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼糧 在北京中地種畜良種奶?？萍紙@選取4 頭體況良好，體重約590±12 kg，妊娠4～5 月齡的三胎荷斯坦奶牛，安裝永久性瘤胃瘺管和十二指腸瘺管，用于瘤胃和十二指腸內(nèi)容物的采集。瘺管牛每天09:00 和21:00 定時(shí)飼喂全混合日糧（Total Mixed Ration，TMR），自由采食，自由飲水，日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.4.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用單因素分期分組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共分3 期，每期正式期7 d，間隔期20 d。第1 期為空白對(duì)照組，不添加任何益生菌；第2 和3 期（試驗(yàn)組）分別在晨飼后1 h（10:00）打開瘤胃瘺管塞投喂植物乳桿菌菌粉和包被植物乳桿菌顆粒。試驗(yàn)組連續(xù)投喂7 d，每天投菌量80 g/ 頭。每期試驗(yàn)最后3 d 連續(xù)采樣，每天采樣時(shí)間點(diǎn)均為晨飼后11 h（本課題組前期研究表明奶牛采食后11 h 各腸段活細(xì)菌比例較高）采集瘤胃液、十二指腸內(nèi)容物以及直腸糞樣。

1.4.3 樣品采集 分別從安裝的瘺管中采集瘤胃和十二指腸內(nèi)容物各50 mL，糞便由直腸直接取樣約5 g。采集的瘤胃液用4 層紗布過(guò)濾后，分裝到無(wú)菌凍存管中；十二指腸和直腸樣品直接分裝于凍存管中。所有樣品取樣后立即投入液氮罐，用于樣品DNA 的提取，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）以及16S rRNA 高通量測(cè)序檢測(cè)。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 產(chǎn)品活菌計(jì)數(shù) 植物乳桿菌菌粉計(jì)數(shù)采用平板菌落計(jì)數(shù)法[16]計(jì)數(shù)。植物乳桿菌微膠囊計(jì)數(shù)：精密稱取1.000 g 包被植物乳桿菌顆粒，加入20 mL PBS 緩沖液（pH=7.4），再加入數(shù)粒玻璃珠于搖床上震蕩，以190 r/min 破壁30 min，制備菌懸液進(jìn)行平板稀釋計(jì)數(shù)。

1.5.2 包埋率測(cè)定 ①微膠囊表面活菌數(shù)：精確稱取1.000 g 植物乳桿菌微膠囊，加入20mL 0.9%的生理鹽水，制備菌懸液后進(jìn)行平板稀釋計(jì)數(shù)。

② 微膠囊活菌數(shù)：同植物乳桿菌微膠囊計(jì)數(shù)方法。

③包埋率=（微膠囊活菌數(shù)-微膠囊表面活菌數(shù)）/微膠囊活菌數(shù)×100%

1.5.3 體外抗逆性評(píng)價(jià) ①體外模擬胃液消化試驗(yàn)：分別精密稱取1.000 g 植物乳桿菌和包被植物乳桿菌，加入20 mL 人工胃液（pH 分別為1、2 和3），于恒溫震蕩搖床34℃、90 r/min 培養(yǎng)2 h，采用平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算活菌數(shù)。② 體外模擬腸道消化試驗(yàn)：分別精密稱取1.000 g 植物乳桿菌和包被植物乳桿菌，加入20 mL人工腸液（膽鹽濃度分別為0.1%、0.2% 和0.3%），于恒溫震蕩搖床34℃、120 r/min 培養(yǎng)2 h，采用平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算活菌數(shù)。

1.5.4 目標(biāo)菌種定量（qPCR） ①基因組DNA 的提?。篋NA提取方法參照DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定DNA 完整性，并用生物分光光度計(jì)測(cè)定DNA 的濃度和純度，-20℃保存?zhèn)溆?。②引物設(shè)計(jì)：根據(jù)NCBI 已報(bào)道的植物乳桿菌JCM-1149 的全基因組序列，設(shè)計(jì)引物序列：上游引物：5'-CGCATAACA ACTTGGACCGC-3'；下游引物：5'-TGTCTCAGTCCC AATGTGGC-3'，產(chǎn)物大小為143 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

③實(shí)時(shí)定量熒光PCR 反應(yīng)體系及程序：反應(yīng)體系為15 μL：7.5 μL SYBR PremixExTaq、PCR上游和下游引物各0.3 μL（引物終濃度為0.2 μmol/L）、ROX Reference Dye 0.3 μL、DNA 模板1 μL，其余用滅菌蒸餾水補(bǔ)齊。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s、60℃退火、延伸，采集熒光信號(hào)34 s，40 個(gè)循環(huán)，在反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔融曲線分析。以不同拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)過(guò)程中到達(dá)熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)Ct 值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算二者的回歸方程。

1.5.5 16S rRNA 高通量測(cè)序 瘤胃和十二指腸內(nèi)容物以及直腸糞便微生物多樣性檢測(cè)選取細(xì)菌16S rDNA V3-V4 區(qū)，樣本所得DNA 送至北京奧維森基因科技有限公司，利用Illumina MiSeq PE300 平臺(tái)（Illumina，Inc.，CA，USA）進(jìn)行Paired-end 測(cè)序。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)輸入軟件Excel 2003 整理，采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件One-way ANOVA 進(jìn)行方差分析，用LSD 法對(duì)組間差異顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著，結(jié)果用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。生物信息分析利用QIIME 平臺(tái)進(jìn)行多樣性矩陣分析。在R（version 3.3.0）軟件中使用VennDiagram 包（1.6.17），各組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)以及P＜0.05 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 包被工藝參數(shù)確定

2.1.1 制粒參數(shù) ①起膜芯粒的適宜比例：利用多孔的微晶纖維空白丸芯（MCC）作為載體基質(zhì)可以提高制粒的穩(wěn)定性，如表2 可知，起膜芯粒（MCC 與海藻酸鈉）比例在10:1 較好。②起膜芯粒與菌泥的混合液用量比例：將起膜芯粒與菌泥（植物乳桿菌）混合制備微液滴，提高制粒的圓球度，便于后續(xù)包被，由表2 可知，二者比例在1:1 較適宜，便于制粒。

表2 制粒參數(shù)

2.1.2 包被參數(shù) 一次包被以海藻酸鈉作為內(nèi)層包衣材料，形成初級(jí)微膠囊，由表3 可知，制粒顆粒與海藻酸鈉包被液之比為4:3 較合理。二次包被采用胃崩快滲型丙烯酸脂類共聚物作為外層包膜，一次包衣顆粒與丙烯酸樹脂的用量為1:4 較適宜。

表3 包衣液用量

2.1.3 產(chǎn)品活菌數(shù) 據(jù)上述工藝參數(shù)，對(duì)植物乳桿菌和包被植物乳桿菌分別加工成成品，為體內(nèi)評(píng)價(jià)試驗(yàn)做準(zhǔn)備，也為保證后期體內(nèi)評(píng)價(jià)試驗(yàn)條件一致，所以每批次生產(chǎn)的活菌數(shù)均控制在同一數(shù)量級(jí)，其活菌數(shù)分別為（8.00±0.07）×109CFU/g 和（7.82±0.17）×109CFU/g。

2.1.4 產(chǎn)品包埋率 對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行包被，通過(guò)平板計(jì)數(shù)得出的平均包埋率達(dá)82%以上（表4）。

表4 植物乳桿菌包埋率

2.2 體外抗逆性評(píng)價(jià) 由表5 可知，植物乳桿菌在pH 1和2 的人工胃液中幾乎不能存活；而當(dāng)pH 達(dá)3 時(shí)，活菌率達(dá)23.25%。包被植物乳桿菌在pH 1 和2 的人工胃液存活率雖不高，但其活菌數(shù)依舊維持在106CFU/g 和108CFU/g 以上，而在pH 3 的人工胃液中其活菌存活率高達(dá)85%。說(shuō)明未包被的植物乳桿菌對(duì)抗胃酸的能力較差。

表5 人工胃液條件下植物乳桿菌活菌數(shù)

由表6 可知，不同處理植物乳桿菌在不同濃度膽鹽中的活菌數(shù)保持在一個(gè)數(shù)量級(jí)上。二者在較低濃度0.10%和0.20%的人工腸液中的活菌率均較高，而在高濃度0.30%的人工腸液中，包被植物乳桿菌的活菌存活率很高，但植物乳桿菌活菌數(shù)仍舊在109CFU/g 以上。說(shuō)明本試驗(yàn)選用的植物乳桿菌具有較強(qiáng)的抗膽鹽能力。

表6 人工腸液條件下植物乳桿菌活菌數(shù)

2.3 體內(nèi)評(píng)價(jià)

2.3.1 包被植物乳桿菌過(guò)瘤胃過(guò)真胃效果 由圖1 可知，Ct 值和拷貝數(shù)呈線性關(guān)系，熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=-2.70x+34.58（y 代表Ct 值，x 代表初始模板量的對(duì)數(shù)），Ct 值從12.57 到27.96 個(gè)循環(huán)，初始模板濃度與Ct 值之間線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9917（R2＞0.90），所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線符合實(shí)時(shí)定量PCR 的要求。

圖1 植物乳桿菌JCM-1149 標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)奶牛胃腸道定量植物乳桿菌JCM-1149 含量如表7 所示。在瘤胃中，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組定量植物乳桿菌JCM-1149 含量均升高，而包被植物乳桿菌組顯著升高（P＜0.01），但3 組qPCR 的值都在1 個(gè)數(shù)量級(jí)上。在十二指腸中，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組定量植物乳桿菌JCM-1149 含量均升高，而包被植物乳桿菌組顯著升高（P＜0.01）；包被植物乳桿菌組qPCR 值高出對(duì)照組和植物乳桿菌組1 個(gè)數(shù)量級(jí)；而未包被的植物乳桿菌與對(duì)照組在1 個(gè)數(shù)量級(jí)，說(shuō)明通過(guò)真胃到達(dá)十二指腸的能力較低。在直腸中，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組定量植物乳桿菌JCM-1149 含量均升高，而包被植物乳桿菌組顯著升高（P＜0.01），分別高出對(duì)照組和植物乳桿菌組2 和1個(gè)數(shù)量級(jí)。

表7 不同處理植物乳桿菌JCM-1149 在各部位的含量 拷貝數(shù)/ng DNA

2.3.2 包被植物乳桿菌對(duì)奶牛胃腸道菌群的影響 由圖2 可知，在門水平，3 個(gè)部位，3 個(gè)分組共獲得22 個(gè)門的分類物種，主要優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、單糖菌門以及變形菌門。

圖2 不同腸段微生物在門水平的變化

通過(guò)Kruskal-wallis 檢驗(yàn)提取差異微生物，再通過(guò)SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)一步分析各組間菌群豐度的差異，共發(fā)現(xiàn)3 個(gè)菌門存在差異。如表8 所示，在瘤胃中，變形菌門和綠彎菌門在各組間差異顯著，添加植物乳桿菌和包被植物乳桿菌均降低變形菌門和綠彎菌門的豐度（P＜0.05）。在十二指腸中，各組間差異不顯著。在直腸中，包被植物乳桿菌降低了廣古菌門豐度（P＜0.05）。由此表明，在門水平，植物乳桿菌組僅對(duì)奶牛瘤胃微生物有一定的影響，而包被植物乳桿菌組對(duì)瘤胃和腸道菌群均有影響。

表8 不同處理植物乳桿菌對(duì)胃腸道菌門的影響 %

由圖3 可知，在屬水平，3 個(gè)部位，3 個(gè)分組共鑒定出322 個(gè)細(xì)菌屬，主要優(yōu)勢(shì)菌屬為普氏菌屬_1、克里斯騰森菌科_R-7_group、毛螺菌科_NK3A20_group、瘤胃球菌科_UCG-005、理研菌科_RC9_gut_group、瘤胃球菌科_NK4A214_group、解琥珀酸菌屬等。

圖3 不同腸段微生物在屬水平的變化

通過(guò)Kruskal-wallis 檢驗(yàn)提取差異菌屬，再通過(guò)SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)一步分析，共有57 個(gè)菌屬存在差異。如表9 所示，在瘤胃中，有34 個(gè)菌屬在各組間存在差異，進(jìn)一步分析差異屬下相對(duì)豐度在1%以上的菌屬。與對(duì)照組相比，包被植物乳桿菌主要提高了厚壁菌門下毛螺菌科的醋香腸菌屬和毛螺菌科_NK3A20_group 屬以及厚壁菌門下瘤胃球菌科的產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌屬的豐度（P＜0.05）；植物乳桿菌提高了擬桿菌門普雷沃氏菌科_UCG-003 屬的豐度（P＜0.05），降低了厚壁菌門下瘤胃球菌科的瘤胃球菌屬_2 的豐度（P＜0.05）。在十二指腸中，5 個(gè)菌屬在各組間存在差異，且各菌屬的含量極低，其中包被植物乳桿菌主要提高了厚壁菌門下毛螺菌科的毛形桿菌屬（Lachnobacterium）的豐度（P＜0.05）。在直腸中，18 個(gè)菌屬在各組間存在差異，進(jìn)一步分析差異菌屬下相對(duì)豐度在1%以上的菌屬。與對(duì)照組相比，包被植物乳桿菌主要提高了厚壁菌門下瘤胃球菌科_UCG-005 屬的豐度（P＜0.05），降低了厚壁菌門下瘤胃球菌科_UCG-013 和擬桿菌門下擬桿菌目的Phocaeicola屬的豐度（P＜0.05）（表9）。由此表明，添加包被植物乳桿菌主要提高了胃腸道中厚壁菌門下毛螺菌科和瘤胃球菌科的菌屬，降低了擬桿菌門下擬桿菌目的Phocaeicola屬的豐度；而植物乳桿菌主要提高了瘤胃中擬桿菌門下的菌屬，降低了厚壁菌門下的瘤胃球菌屬_2 的豐度，而對(duì)腸道菌屬的影響較小。

表9 不同處理植物乳桿菌對(duì)胃腸道菌屬的影響 %

3 討 論

3.1 包被植物乳桿菌工藝的確定 包被技術(shù)是近年來(lái)廣泛應(yīng)用于提高益生菌產(chǎn)品抗逆性的一種新技術(shù)，是一種利用包材（壁材）包裹或密封芯材，在特定條件下以可控速度釋放芯材的技術(shù)[17-18]。常用的壁材有天然材料、半合成材料以及高分子材料。天然材料中海藻酸鹽和殼聚糖來(lái)源豐富、價(jià)格合理，適于工廠化加工生產(chǎn)，其特點(diǎn)是成膜性好、生物相容性好、降解物無(wú)毒。半合成材料多為纖維素類衍生物。合成材料有聚酯、聚乙烯、聚丙烯酰胺以及樹脂等，但價(jià)格較高，生物相容性不好。目前常將天然材料與合成高分子材料混合作為包被材料[19]。本試驗(yàn)采用微晶纖維素空白丸芯造粒，作為微丸造粒的起膜芯粒，不僅有效解決制粒中真球度低、顆粒均勻度差的問(wèn)題，而且兼具稀釋-粘合-崩解三合劑的作用。以植物乳桿菌為囊芯物，海藻酸鈉為內(nèi)層包被材料，形成初級(jí)微膠囊，此為一次包被。一次包被的目的是利用海藻酸鈉對(duì)pH 敏感，在真胃中低pH 的情況下不破損，而在腸道中堿性環(huán)境可以快速釋放。二次包被采用丙烯酸脂類共聚物成品作為外層包膜，二次包被依據(jù)外層包衣對(duì)瘤胃和真胃pH 的差距，可以耐受瘤胃的pH，不易被微生物分解，而在比瘤胃低的pH 值的真胃內(nèi)被快速分解。分解后的丙烯酸樹脂，暴露出內(nèi)層海藻酸鈉繼續(xù)保護(hù)益生菌免受胃酸侵蝕，待進(jìn)入動(dòng)物腸道后將囊芯釋放出來(lái)。

目前對(duì)微生態(tài)制劑的使用劑量還沒(méi)有形成一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)際乳業(yè)聯(lián)盟（The International Dairy Federation，IDF）推薦每克或者每毫升益生菌產(chǎn)品不得低于107的有效活菌數(shù)[20]。而食品農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織建議，任何益生產(chǎn)品的理想活菌數(shù)不應(yīng)少于106～107CFU/mL[21]。本試驗(yàn)采用WBF-1G 型多用途流化床進(jìn)行頂噴包被制備植物乳桿菌微膠囊，經(jīng)過(guò)多次預(yù)試驗(yàn)獲得較佳的工藝參數(shù)，使得每批產(chǎn)品的活菌數(shù)都穩(wěn)定在109CFU/g，符合益生菌產(chǎn)品推薦的有效活菌數(shù)量級(jí)。

包埋率是檢驗(yàn)益生菌包被成功與否的一個(gè)因素。同時(shí)通過(guò)平板計(jì)數(shù)，其包埋率達(dá)到80% 以上，介于不少文獻(xiàn)及發(fā)明專利中提及的益生菌微膠囊包埋率（60%～90%）[22-24]。

3.2 體外抗逆性評(píng)價(jià) 乳酸菌作為一種益生菌，對(duì)胃腸道具有一定的耐受性是發(fā)揮益生功能的前提條件[25]。一般哺乳動(dòng)物胃內(nèi)pH 為2 左右，而胃蛋白酶的最適pH 值也為2，這種酸性環(huán)境可以殺死隨食物進(jìn)入胃內(nèi)的細(xì)菌。關(guān)于乳酸菌耐酸機(jī)制已有諸多研究[26]。本試驗(yàn)中，未包被的植物乳桿菌在低pH 1～2 時(shí)，無(wú)法存活，當(dāng)pH 升高到3 時(shí)，活菌存活率僅為20%；而包被后的植物乳桿菌在低pH 1～2 時(shí)，其活菌存活率也很低，但其活菌數(shù)也可達(dá)到1×106CFU/g 以上，當(dāng)pH 升高到3時(shí)，活菌存活率達(dá)85% 以上。據(jù)報(bào)道，當(dāng)人或動(dòng)物攝入含有1×106CFU/g 或以上的活性乳酸菌就能發(fā)揮其益生作用[27]，表明包被后的植物乳桿菌對(duì)低pH 和胃蛋白酶均有一定程度的耐受性，能以一定數(shù)量的活菌順利到達(dá)腸道。

乳酸菌要在腸道中存活并定植于腸道，因而對(duì)腸道的耐受力要比對(duì)胃液的耐受力更為重要。小腸是益生菌發(fā)揮功效的場(chǎng)所，內(nèi)含胰液、膽汁和小腸液，而正常哺乳動(dòng)物小腸中膽汁的濃度為0.03%～0.3%[28]。本試驗(yàn)把乳酸菌加于較高濃度梯度的膽鹽腸液中，發(fā)現(xiàn)乳酸菌對(duì)膽鹽的耐受力均較強(qiáng)，而包被后的植物乳桿菌幾乎不受高濃度膽鹽的影響。說(shuō)明本試驗(yàn)選用的植物乳桿菌菌株和所采用的包被技術(shù)能對(duì)抗膽鹽等形成的高滲透壓及胰蛋白酶的分解作用，可以進(jìn)一步研究其在體內(nèi)的功效。

3.3 包被植物乳桿菌過(guò)瘤胃過(guò)真胃效果 據(jù)報(bào)道，益生菌等活細(xì)菌被用于調(diào)節(jié)動(dòng)物體的腸道菌群和生理機(jī)能，但它們的定殖往往是一過(guò)性的[29]。而不同研究者發(fā)現(xiàn)食用益生菌通過(guò)胃進(jìn)入腸道活菌數(shù)量較少，可能其在進(jìn)入腸道之前就已滅活，類似的研究多集中于體外模擬胃腸道條件進(jìn)行驗(yàn)證[24-25]。本研究通過(guò)造瘺術(shù)獲取胃腸道真實(shí)環(huán)境樣品，進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證，并依據(jù)定量微生物多采用qPCR 技術(shù)，可以快速、精確定量腸道核酸含量，試圖通過(guò)比較瘤胃與腸道中植物乳桿菌數(shù)量的變化，來(lái)檢驗(yàn)包被植物乳桿菌過(guò)瘤胃、過(guò)真胃，到達(dá)腸道的能力。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在瘤胃、真胃和腸道中，包被植物乳桿菌組qPCR 值顯著高于對(duì)照組和植物乳桿菌組，這與多數(shù)研究結(jié)果類似。Anselmo 等[11]采用海藻酸鈉和殼聚糖對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌進(jìn)行逐層包被，結(jié)果表明：在體外模擬胃酸（pH=2）和膽鹽（4%）2 h 后，雙層包被的凝結(jié)芽孢桿菌較單層包被的凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)提高了4 個(gè)數(shù)量級(jí)；采用體內(nèi)模擬小腸模型（MatTek EpiIntestinal），口服益生菌在被遞送到靶點(diǎn)的過(guò)程中不受到胃腸道環(huán)境的影響，同時(shí)提升了益生菌在腸道中的粘附性。Li 等[30]用碳酸鈣與纖維素做包材，可將高達(dá)1010CFU/g 的植物乳桿菌包裹在內(nèi)，釋放出的活菌數(shù)可達(dá)3×1010CFU/g，在模擬胃部環(huán)境不受pH 影響，而在腸道靶點(diǎn)釋放。由此表明，本試驗(yàn)所采用的雙層包被植物乳桿菌可以避免瘤胃微生物的降解，抵御真胃胃酸的侵蝕，最后順利到達(dá)腸道，顯著提高益生菌在體內(nèi)的存活率。

3.4 包被植物乳桿菌對(duì)奶牛胃腸道菌群的影響 本試驗(yàn)中，植物乳桿菌僅影響瘤胃中的菌門和相關(guān)菌屬豐度，包被植物乳桿菌對(duì)瘤胃和腸道的菌門和相關(guān)菌屬均有影響，說(shuō)明包被處理后的植物乳桿菌能順利到達(dá)腸道，進(jìn)而對(duì)腸道菌群產(chǎn)生潛在的影響。在瘤胃中，不同處理植物乳桿菌均顯著降低了變形菌門和綠彎菌門豐度。變形菌門是細(xì)菌中最大的一個(gè)門，包括很多致病菌，添加不同處理的植物乳桿菌可能對(duì)變形菌門形成競(jìng)爭(zhēng)和拮抗作用，起到益生作用[31]。綠彎菌門是一類進(jìn)行不產(chǎn)氧光合作用的細(xì)菌，對(duì)水體環(huán)境影響較大[32]。添加不同處理植物乳桿菌降低其豐度可能跟菌株本身的特性有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，在直腸中僅包被植物乳桿菌顯著降低了廣古菌門豐度。廣古菌門包含了古菌中大多數(shù)種類，在動(dòng)物腸道中以產(chǎn)甲烷菌為主，添加的包被植物乳桿菌可能會(huì)抑制廣古菌門中產(chǎn)甲烷菌豐度，對(duì)維持腸道健康有益。在屬水平，包被植物乳桿菌對(duì)奶牛胃腸道菌群均有較大影響，而植物乳桿菌僅對(duì)瘤胃的影響較大，在十二指腸和直腸中幾乎未檢測(cè)到顯著的菌屬，可能未經(jīng)保護(hù)的植物乳桿菌多數(shù)不能到達(dá)腸道靶向釋放。包被植物乳桿菌降低了直腸中擬桿菌門下的菌屬，提高了厚壁菌門下的某些菌屬，這與一項(xiàng)人類的研究結(jié)果類似，服用含植物乳桿菌的復(fù)合益生菌制劑可以降低便秘患者腸道內(nèi)的擬桿菌門的豐度，而提高厚壁菌門的相對(duì)豐度[33]。

物種組成與差異分析表明，不同處理的植物乳桿菌對(duì)奶牛胃腸道中厚壁菌門和擬桿菌門下的菌屬影響較大，說(shuō)明腸道微生物能夠?qū)χ参锶闂U菌的介入產(chǎn)生迅速反應(yīng)，這可能與各菌門的代謝產(chǎn)物（VFA）有關(guān)。有報(bào)道指出，擬桿菌門以生成乙酸和丙酸為主，乙酸、丙酸可以抑制腫瘤壞死因子的釋放，對(duì)結(jié)腸炎有很好的療效；而厚壁菌門則以生成丁酸為主，丁酸對(duì)預(yù)防治療結(jié)腸癌有良好的療效[34-36]。本試驗(yàn)中57 個(gè)關(guān)鍵菌屬中大部分是對(duì)腸道健康有益的。植物乳桿菌主要提高瘤胃中擬桿菌門下普氏菌屬豐度，降低了厚壁菌門下的瘤胃球菌屬_2 豐度。普氏菌屬在瘤胃中可降解并利用淀粉和植物細(xì)胞壁多糖，同時(shí)參與蛋白質(zhì)的降解以及對(duì)肽的吸收和發(fā)酵起作用[37]。瘤胃球菌屬在腸道中豐度較高，能促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，可以防止機(jī)體營(yíng)養(yǎng)不良[38]。包被植物乳桿菌主要提高瘤胃中醋香腸菌屬、毛螺菌科_NK3A20_group 以及產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌屬的豐度；提高十二指腸中毛形桿菌屬豐度；提高直腸中瘤胃球菌科_UCG-005 豐度，降低瘤胃球菌科_UCG-013 和Phocaeicola豐度，這些菌屬主要來(lái)自厚壁菌門下毛螺菌科和瘤胃球菌科的菌屬。瘤胃球菌科和毛螺菌科是厚壁菌門下梭菌目的最豐富的2 個(gè)家族，可以參與到將碳水化合物分解為SCFAs 的過(guò)程中[39-40]，負(fù)責(zé)多種多糖和纖維的降解，與維持腸道健康有關(guān)。毛螺菌屬對(duì)結(jié)腸患者和炎癥性腸病患者具有保護(hù)作用[41-42]，與其能產(chǎn)生丁酸有關(guān)，同時(shí)毛螺菌科菌可以抵制艱難梭菌的定植，并且可以用于治療與預(yù)防艱難梭菌引起的偽腺性腸炎等疾病[43]。植物乳桿菌本身屬于厚壁菌門下的菌屬，以上結(jié)果再次證明經(jīng)過(guò)包被處理后的植物乳桿菌可以順利達(dá)到腸道而靶向釋放，進(jìn)而提高胃腸道中厚壁菌門下的菌屬。本試驗(yàn)中同一菌株植物乳桿菌經(jīng)過(guò)包被處理后的效果強(qiáng)于未經(jīng)包被的植物乳桿菌，說(shuō)明包被植物乳桿菌可以順利到達(dá)腸道發(fā)揮益生作用。

4 結(jié) 論

在理想制粒和包被工藝參數(shù)下，植物乳桿菌微膠囊活菌數(shù)和包埋率分別達(dá)到109CFU/g 和82.48%，包被后的植物乳桿菌對(duì)抗胃酸和膽鹽的抗逆性好；經(jīng)包被處理的植物乳桿菌微膠囊過(guò)瘤胃、過(guò)真胃以及達(dá)到腸道的能力極顯著高于對(duì)照組和未包被的植物乳桿菌組；包被植物乳桿菌組對(duì)奶牛瘤胃和腸道菌群均有一定的調(diào)控作用，而植物乳桿菌組僅對(duì)奶牛瘤胃菌群有一定的影響。包被植物乳桿菌微膠囊具備作為微生物添加劑的潛力，并對(duì)相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)具有一定的參考價(jià)值。