宋姍姍，楊艾華，周艷萌，許譯文，賢 浩，李成玉，王微微

(遵義醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，貴州 遵義 563000)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)是一種人獸共患病原菌，可導致人和動物的多種疾病(包括腹膜炎、心內膜炎、肺炎等)，嚴重威脅人類和動物的生命安全[1]。當前，抗生素依然是治療金黃色葡萄球菌感染的主要藥物，然而，由于傳統(tǒng)的抗菌藥物容易引起病原菌產生耐藥性以及抗生素研發(fā)的緩慢，臨床可能面臨無藥可用的窘境。

天然藥用植物因具有安全性高、毒副作用小和不易產生耐藥性等優(yōu)點，越來越受到人們的關注[2-3]。研究表明，藥用植物的抗菌機制主要包括改變細菌生物被膜的通透性、抑制參與菌體代謝的酶活性、影響細菌蛋白質和核酸的合成等[4]。藥用植物中活性成分除了作用于病原體外，還可通過增強機體自身的免疫力來發(fā)揮其抑菌活性[5-6]。由此可見，藥用植物的有效藥物成分復雜，其抗菌作用可通過多種途徑來綜合實現，因此，需依據藥用植物的有效藥物成分的自身特點，采用體外試驗和體內試驗來全面地評價其抗菌作用和抗菌效果。

傳統(tǒng)體內藥效評價模型常使用哺乳動物，存在試驗周期長、效率低、成本高等問題，無法滿足藥物研發(fā)高通量篩選的需要[7-8]。秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)具有通體透明、易觀察、易培養(yǎng)、繁殖快、與人類同源基因多等優(yōu)點，在新抗菌藥物開發(fā)領域受到眾多學者的關注，為促進新型抗菌藥的探索提供了一個更方便的工具[9-13]。本試驗應用傳統(tǒng)水煎法制備火炭母水煎液，通過瓊脂平板法、微量肉湯稀釋法和秀麗隱桿線蟲-金黃色葡萄球菌感染模型等體內和體外試驗，綜合地評價火炭母水煎液對金黃色葡萄球菌的抑菌作用，以期為進一步研究和應用火炭母提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 制霉菌素、5-氟尿嘧啶脫氧核苷(5-FUDR)，均購自北京索萊寶科技有限公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，均購自北京奧博星生物技術有限公司；苯酚、硝酸鋁、亞硝酸鈉、硫酸等有機試劑，均購自阿拉丁試劑(上海)有限公司。

1.2 主要儀器 超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；恒溫水浴鍋、電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；高速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 實驗菌種和模式生物 大腸桿菌(Escherichiacoli)OP50、金黃色葡萄球菌(編號：CMCC-26003，中國醫(yī)學細菌保藏管理中心標準菌株)和野生型秀麗隱桿線蟲(WT Bristol N2)，均由遵義醫(yī)科大學微生物與免疫學實驗室提供。

1.4 火炭母水煎液的制備 準確稱取火炭母干燥粉末50.0 g，加10倍體積蒸餾水浸泡30 min，加熱煮沸后連續(xù)煎煮30 min，4層紗布過濾，收集濾液，藥渣再加10倍體積蒸餾水，重復煎煮并過濾。合并濾液，加熱濃縮至50 mL，制成生藥含量為1.0 g/mL的火炭母藥液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 主要活性成分的測定 參照趙仕花等[14]的苯酚-硫酸法，以無水葡萄糖為對照品，測定多糖含量；參照Li等[15]的硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法，以蘆丁為對照品，測定黃酮含量；參照Ebrahimabadi等[16]的Folin-ciocalteu法，以沒食子酸為對照品，測定多酚含量。

1.6 體外抑菌試驗

1.6.1 供試菌液的制備 將金黃色葡萄球菌接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，然后挑取單菌落接種于肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)6 h后，用生理鹽水將菌液校正至0.5麥氏比濁標準[17]。

1.6.2 抑菌圈的測定 采用牛津杯法，取金黃色葡萄球菌菌液100 μL，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，然后在瓊脂平板上間隔放置孔徑6 mm的牛津杯，孔間距>20 mm。試驗組：不同濃度(1 000、800、600、400 mg/mL和200 mg/mL)火炭母藥液100 μL；陽性對照組：10 μg/mL環(huán)丙沙星100 μL；陰性對照組：生理鹽水100 μL。37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后，觀察結果，測量并計算抑菌圈平均值[18]。判定標準：當抑菌圈直徑≥20 mm時，表示極度敏感；當15 mm≤抑菌圈直徑<20 mm時，表示高度敏感；當10 mm≤抑菌圈直徑<15 mm時，表示中度敏感；當6 mm≤抑菌圈直徑<10 mm時，表示低度敏感或者耐藥[19]。

1.6.3 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定 采用微量肉湯稀釋法測定火炭母藥液對不同菌株的MIC。具體方法：使用營養(yǎng)肉湯將菌液稀釋100倍[20]，然后吸取100 μL菌液加于96孔培養(yǎng)板的第1～10孔，之后將不同濃度(1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.80、3.91 mg/mL和1.95 mg/mL)的藥液100 μL加至第1～10孔；空白對照孔(第11孔)：營養(yǎng)肉湯200 μL，檢測培養(yǎng)基是否污染；陰性對照孔(第12孔)：菌液200 μL，檢測菌液是否生長良好，每孔重復3次[21]。接種完成后，將96孔培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，觀察其MIC。將最低抑菌濃度以上的幾個濃度細菌接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，觀察，菌落數小于5個的最小稀釋度的藥物濃度即為MBC[22]。

1.7 體內抑菌試驗

1.7.1 線蟲的培養(yǎng)及同步化處理 參照Brenner[23]的方法，在顯微鏡下挑取處于產卵期的單個雌雄同體的線蟲轉移到涂有E.coliOP50的NGM培養(yǎng)基中，20 ℃培養(yǎng)。選取含較多產卵期線蟲的NGM平板，M9緩沖液將線蟲沖洗、收集、離心。棄上清液，加入1.5 mL線蟲裂解液，劇烈振蕩8 min，至蟲體全部裂解，迅速離心，棄上清液，用M9吹洗3次，離心，沉淀即可得到蟲卵。收集蟲卵，20 ℃靜置培養(yǎng)24 h，即可得到L1期線蟲。將L1期線蟲收集至涂布有E.coliOP50的NGM培養(yǎng)基上，20 ℃培養(yǎng)48 h，即可得到同步化的L4期線蟲[24]。

1.7.2 秀麗隱桿線蟲-金黃色葡萄球菌感染模型的建立 吸取50 μL不同濃度的金黃色葡萄球菌菌懸液，均勻涂布在NGM平板上。感染組1：菌液濃度為1.5×109CFU/mL；感染組2：菌液濃度為1.5×108CFU/mL；感染組3：菌液濃度為1.5×107CFU/mL；感染組4：菌液濃度為1.5×106CFU/mL。室溫下干燥20 min后，置于37 ℃培養(yǎng)8 h，取出室溫放置。轉接20條L4期線蟲于感染平板上，并滴加一定濃度的5-FUDR，防止線蟲繁殖。對照組：1.5×109CFU/mL 的E.coliOP50。20 ℃培養(yǎng)，每隔24 h觀察1次線蟲的存活，當其身體僵直且對觸碰無反應則判定為死亡。記錄線蟲的平均生存時間和中位生存時間(LT50)。LT50即生存率在50%時對應的時間，因此，記錄10條線蟲死亡的時間。

1.7.3 火炭母水煎液對感染線蟲的救治 確定細菌感染濃度，L4期線蟲感染3 d后，將感染后的線蟲用含有1 mmol/L NaN3的M9緩沖液洗滌，離心，棄上清液，重復3次后，收集蟲體，取20條感染線蟲轉移至不同濃度的藥物平板上，每組3個重復，并于20 ℃恒溫靜置培養(yǎng)。試驗組1：加入1 000 mg/mL的火炭母藥液100 μL；試驗組2：加入800 mg/mL的火炭母藥液100 μL；試驗組3：加入600 mg/mL的火炭母藥液100 μL；試驗組4：加入400 mg/mL的火炭母藥液100 μL；試驗組5：加入200 mg/mL的火炭母藥液100 μL；陽性對照組：加入10 μg/mL環(huán)丙沙星100 μL；對照組：E.coliOP50喂養(yǎng)線蟲。每組設置3次平行試驗，每隔24 h觀察1次線蟲的存活。

1.8 統(tǒng)計分析 采用軟件SPSS 21.0進行統(tǒng)計學分析，Kaplan-Meier法繪制線蟲生存曲線，Graph Pad Prism 7進行Pearson相關性分析，Log Rank檢驗法進行組間差異比較。P<0.05表明具有顯著性差異，P<0.01表明具有極顯著性差異。

2 結果

2.1 火炭母水煎液主要活性成分測定 本試驗以傳統(tǒng)水煎法制備火炭母水煎液，取1 mL 1.0 g/mL水煎液測定多糖、黃酮和多酚含量，結果見表1。

表1 火炭母水煎液中多糖、黃酮和多酚含量

2.2 火炭母水煎液對金黃色葡萄球菌的抑菌活性 本試驗采用牛津杯法測定了火炭母水煎液對金黃色葡萄球菌的抑菌活性，結果見表2。當火炭母水煎液濃度≥200 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌有抑制效果；濃度在1 000 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為(17.5±0.1)mm，屬于高度敏感。

表2 抑菌圈直徑大小隨火炭母水煎液濃度的變化

2.3 火炭母水煎液MIC和MBC的測定 采用微量肉湯稀釋法，觀察培養(yǎng)板澄清度確定火炭母水煎液對金黃色葡萄球菌的MIC。結果顯示，火炭母水煎液濃度在7.80～1.95 mg/mL時，培養(yǎng)板內液體渾濁，有菌生長；在500～15.63 mg/mL時，培養(yǎng)板內液體澄清透明，無渾濁現象，最終確定火炭母水煎液對金黃色葡萄球菌的MIC為15.63 mg/mL。取該藥物濃度范圍的培養(yǎng)孔內液體進行涂板，菌落計數，最終確定火炭母水煎液對金黃色葡萄球菌的MBC為31.25 mg/mL。

2.4 秀麗隱桿線蟲-金黃色葡萄球菌感染模型的建立 金黃色葡萄球菌濃度可以影響線蟲感染的程度，故選擇不同濃度的細菌(1.5×109、1.5×108、1.5×107CFU/mL和1.5×106CFU/mL)對線蟲進行感染，以確定建立線蟲感染模型的最佳金黃色葡萄球菌濃度并構建模型，結果見圖1和表3。對照組線蟲最長生存時間為20 d，感染組1感染線蟲最長生存時間為15 d；隨著金黃色葡萄球菌菌液濃度的增加，線蟲中位生存時間(LT50)逐漸縮短。采用Log Rank檢驗顯示，感染組3和感染組4與對照組的生存曲線無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，提示該菌液濃度對線蟲無明顯致死效果；感染組1和感染組2的生存率均低于對照組，并且生存曲線與對照組均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，說明菌液濃度范圍在1.5×109～1.5×108CFU/mL時，金黃色葡萄球菌感染可造成線蟲顯著的致死效果，其中感染組1與對照組的差異極顯著(P<0.01)，說明該組對線蟲的致死作用更強。因此，選用感染組1，即金黃色葡萄球菌菌液濃度為1.5×109CFU/mL用于構建線蟲感染模型和感染線蟲的救治試驗。

圖1 不同濃度金黃色葡萄球菌感染線蟲的生存曲線

表3 不同濃度金黃色葡萄球菌感染后線蟲的生存時間

2.5 火炭母水煎液對感染后線蟲的救治 采用濃度分別為1 000、800、600、400 mg/mL和200 mg/mL的火炭母水煎液對金黃色葡萄球菌感染線蟲進行救治試驗，以線蟲是否死亡為結局變量，記錄線蟲的生存狀況，以分析不同濃度藥物對感染線蟲的救治情況。結果見圖2和表4。1.5×109CFU/mL金黃色葡萄球菌感染線蟲，試驗組1線蟲生存時間延長了4 d；與對照組相比，試驗組1和試驗組2的藥液可以明顯地提高線蟲的存活率，并且生存曲線與對照組有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；試驗組3、試驗組4和試驗組5的藥液幾乎無明顯救治效果，說明在800～1 000 mg/mL的藥物濃度范圍內，藥液能夠有效治療金黃色葡萄球菌感染的線蟲。

表4 不同濃度火炭母水煎液對感染后線蟲生存時間的影響

圖2 不同濃度的火炭母水煎液治療感染線蟲的生存曲線

2.6 火炭母水煎液成分含量與抑菌活性的相關性 由表5可知，通過Pearson相關性分析，隨著火炭母水煎液成分含量的增加，其抑制金黃色葡萄球菌的活性逐漸增強，具有相關性。其中，3種活性成分相比較，火炭母水煎液抑菌活性與黃酮含量的相關性最強，與黃酮具有抗炎、抗病毒、抗肝炎等藥理作用相符。但火炭母水煎液的活性功效除受成分含量影響外，還與活性物質成分間的協同作用以及其他因素有關。因此，火炭母水煎液生物學活性不能僅從其活性物質含量的高低進行推測。

表5 火炭母水煎液活性成分與功效的相關性

3 討論

近年來，隨著抗生素廣泛和大量的使用，細菌耐藥率越來越高，促使人類必須不斷開發(fā)新的抗菌藥物。由于天然藥用植物抗感染是利用其多種復雜有效成分調節(jié)機體平衡、提高機體免疫力，單純體外試驗無法確定藥物效果，需體內外試驗綜合評價天然藥用植物的抗菌作用[25]。因此，本試驗采用牛津杯法和微量肉湯稀釋法測定火炭母水煎液對金黃色葡萄球菌的體外抑菌作用，確定了火炭母水煎液對金黃色葡萄球菌的MIC為15.63 mg/mL、MBC為31.25 mg/mL，隨后建立秀麗隱桿線蟲-金黃色葡萄球菌感染模型，體內試驗結果顯示在800～1 000 mg/mL藥物濃度范圍內，火炭母水煎液對金黃色葡萄球菌感染的線蟲有救治作用。

秀麗隱桿線蟲作為一種簡單、公認的新型模式生物在醫(yī)學領域被廣泛應用，包括細菌致病機制和抗生素篩選等研究[26]。周雨朦等[9]建立了秀麗隱桿線蟲-耐藥銅綠假單胞菌感染模型，并將其作為整體生物模型，用于排除毒性高且體內外相關性差的抗生素。本試驗通過建立秀麗隱桿線蟲-金黃色葡萄球菌感染模型，評價了火炭母水煎液對線蟲感染金黃色葡萄球菌后的治療效果，基于對不同濃度的火炭母水煎液對金黃色葡萄球菌感染后線蟲生存時間的觀察，結果顯示高濃度的火炭母水煎液能夠延長感染后線蟲的生存時間，但對生存時間的影響為非濃度依賴性，即隨著濃度的增加，線蟲生存時間并無明顯變化。

本試驗選取了天然藥用植物火炭母，通過體外試驗和體內試驗確定了其水煎液對金黃色葡萄球菌具有抑菌效果，為金黃色葡萄球菌感染的治療提供了新思路。本試驗結果發(fā)現，火炭母的藥理功效與其有效成分含量存在相關性，因而，在后續(xù)研究中將對火炭母水煎液中的有效成分進行分離純化，分析各有效成分的抗菌效果，以期為火炭母抗菌成分的研究及應用提供參考依據。