劉秀坤，韓冉，李曉明，解樹斌，李法計(jì)，陳亞鵬，翟勝男，李豪圣，劉建軍，趙振東，張玉梅，曹新有

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 青島 266109；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/小麥玉米國(guó)家工程中心/農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山東省小麥技術(shù)創(chuàng)新中心，山東 濟(jì)南 250100；3.山東魯研農(nóng)業(yè)良種有限公司，山東 濟(jì)南 250100；4.滕州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 滕州 277599)

小麥?zhǔn)俏覈?guó)第二大糧食作物[1]，2010—2019年平均種植面積在2400萬公頃左右。小麥具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和特殊的面筋特性，可用于多種食品的加工，為人類提供21%的食物熱量和20%的蛋白質(zhì)[2]。

小麥?zhǔn)窍矝鲎魑?，日均?0～24℃最適合其籽粒灌漿，超過30℃會(huì)對(duì)籽粒灌漿和品質(zhì)造成影響[3]。研究表明，灌漿期高溫天氣頻發(fā)會(huì)使小麥灌漿速率降低[4]，灌漿時(shí)間縮短[5]，造成小麥籽粒灌漿不充分，降低小麥產(chǎn)量；全球氣溫每上升1℃，小麥減產(chǎn)6%[6]。根據(jù)濟(jì)南市氣象局的溫度記錄，2017—2021年間小麥灌漿期日均溫在27～30℃，最高可達(dá)35℃，這不僅會(huì)降低小麥產(chǎn)量，還會(huì)對(duì)小麥品質(zhì)造成影響[7]。麥谷蛋白含量與醇溶蛋白含量的比值影響小麥的面筋特性，灌漿中后期高溫，麥谷蛋白含量降低，醇溶蛋白含量增加，使麥谷蛋白含量與醇溶蛋白含量比值減小，降低面筋強(qiáng)度[8]。與此同時(shí)，灌漿期溫度超過30℃，會(huì)使小麥淀粉含量降低，面團(tuán)強(qiáng)度下降，影響其加工品質(zhì)[9]。

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中往往會(huì)遭受諸多非生物因素脅迫，如鹽堿、低溫、干旱、高溫等，這些非生物脅迫會(huì)使代謝過程紊亂，致使細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)積累，影響植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育[10]。目前，植物抵御高溫脅迫的機(jī)理研究已取得了較大進(jìn)展，與耐熱相關(guān)的基因也在陸續(xù)挖掘和驗(yàn)證。田雪軍在小麥中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)耐熱基因——TaMBF1c和TaMYB85，熱脅迫條件下，TaMBF1c的缺失突變體在微管運(yùn)輸、脅迫響應(yīng)、蛋白質(zhì)加工代謝等途徑中相關(guān)基因的翻譯效率降低，而過表達(dá)TaMBY85基因的擬南芥和小麥耐熱性提高[11]。高溫脅迫會(huì)促進(jìn)植物體熱激蛋白(heat shock protein)的轉(zhuǎn)錄和翻譯，而熱激蛋白具有維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和正常生理功能的作用。Montero-Barrientos等研究表明，轉(zhuǎn)哈氏芽孢桿菌hsp70基因的擬南芥表現(xiàn)出了更高的耐熱性，且植株生長(zhǎng)并沒有受到抑制，在經(jīng)過高溫預(yù)處理后表現(xiàn)出了更好的抵御逆境脅迫的能力[12]。Katiyar-Agarwal等將擬南芥基因Athsp101導(dǎo)入水稻中，轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出更高的耐熱能力，高溫脅迫后產(chǎn)量沒有顯著下降[13]。在受到熱脅迫后，小麥熱激轉(zhuǎn)錄因子TaHsfA1能促進(jìn)熱激蛋白的表達(dá)，提高擬南芥幼苗的耐熱性[14]。因此，明晰耐熱調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，挖掘耐熱相關(guān)基因，利用分子育種等手段選育耐熱品種，對(duì)提高小麥耐熱性具有重要意義。

本試驗(yàn)以本課題組前期研究中篩選到的小麥耐熱品種菏麥13和熱敏感品種臨麥2號(hào)[15]為試材，經(jīng)熱脅迫處理，運(yùn)用RNA－seq技術(shù)對(duì)灌漿期旗葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，以挖掘熱脅迫相關(guān)基因，為后續(xù)進(jìn)一步研究耐熱脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、選育耐熱新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選用耐熱品種菏麥13和熱敏感品種臨麥2號(hào)為材料，于2018年10月中旬正常播種于埋置在大田的花盆中，每盆10粒，按大田常規(guī)管理，待出苗后間苗，每盆留5株。每份材料種4盆。

1.2 樣品處理及分類

花后14 d，將4盆材料(2盆菏麥13和2盆臨麥2號(hào))移至人工氣候箱，42℃處理0、1 h，剩余4盆留至原處作為對(duì)照。取主穗同等部位的旗葉于－80℃冰箱保存。所取樣品按照以下方案進(jìn)行分類，用于后續(xù)的RNA－seq及分析。

表1 樣品分類及差異分析對(duì)比方案

1.3 文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

提取樣品總RNA并使用DNaseⅠ消化DNA后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA，向得到的mRNA中加入適量打斷試劑，高溫條件下使其片斷化，再以片斷后的mRNA為模板，合成cDNA，經(jīng)過磁珠純化、末端修復(fù)、3′末端加堿基A、加測(cè)序接頭后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫(kù)制備工作。構(gòu)建好的文庫(kù)用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real－Time PCR System進(jìn)行質(zhì)量和產(chǎn)量檢測(cè)，文庫(kù)質(zhì)控合格后進(jìn)行測(cè)序。

1.4 原始數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計(jì)及質(zhì)量分析

應(yīng)用base calling將測(cè)序得到的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成序列信息，為了保證信息分析的可靠性，需對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行一系列的處理:去除含adapter的reads，去除含N比例大于10%的reads，去除低質(zhì)量的reads(從整體上，Q≤20的堿基比例較低表明測(cè)序質(zhì)量較好)，從而獲得clean reads。

1.5 差異基因的篩選

基于泊松分布分析方法，通過控制FDR(錯(cuò)誤發(fā)生率)，根據(jù)表達(dá)量(FPKM值)計(jì)算基因在不同樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)，以FDR≤0.001、≥2為標(biāo)準(zhǔn)篩選兩樣本間的差異基因。

1.6 轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜qRT－PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，需要對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。我們隨機(jī)選取了20個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT－PCR驗(yàn)證。利用Primer Premier 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表2)。

表2 qRT－PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序質(zhì)量分析

從整體上看，樣本的CG含量在53.34%～55.08%之間，Q20比例在98.95%以上，Q30比例在96.26%以上(表3)。說明樣本的質(zhì)量較好，可用于下一步分析。

表3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.2 差異基因的篩選結(jié)果

最終4個(gè)對(duì)比方案共獲得4715個(gè)差異基因(圖1)。臨麥2號(hào)葉片0 h－vs－臨麥2號(hào)葉片1 h檢測(cè)出1527個(gè)差異表達(dá)基因，菏麥13葉片0 h－vs－菏麥13葉片1 h檢測(cè)出1190個(gè)差異表達(dá)基因，說明小麥旗葉中某些基因?qū)Ω邷孛{迫做出響應(yīng)，在高溫條件下表達(dá)。臨麥2號(hào)葉片0 h－vs－菏麥13葉片0 h檢測(cè)到1225個(gè)差異表達(dá)基因，臨麥2號(hào)葉片1 hvs－菏麥13葉片1 h檢測(cè)到773個(gè)差異表達(dá)基因，說明在高溫脅迫下某些基因會(huì)沉默，不表達(dá)。

圖1 樣品差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)

2.3 轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜qRT－PCR驗(yàn)證

隨機(jī)選擇20個(gè)耐熱基因進(jìn)行qRT－PCR驗(yàn)證(圖2)，其中11個(gè)上調(diào)表達(dá)，如與逆境脅迫相關(guān)基因Rps7和Snf1、熱脅迫相關(guān)基因MADS等；9個(gè)下調(diào)表達(dá)，如氧化脅迫相關(guān)基因Beta－carotene hydroxylase、核小體蛋白亞基H2B等。qRT－PCR驗(yàn)證結(jié)果表明表達(dá)趨勢(shì)與RNA－seq測(cè)序分析結(jié)果一致，證明了RNA－seq測(cè)序結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，也為下一步確定候選基因并進(jìn)行深入研究提供了參考。

圖2 差異基因的qRT－PCR驗(yàn)證

2.4 差異基因GO顯著富集分析

將獲得的目的基因進(jìn)行GO富集分析，主要從基因的分子功能(molecular function)、所處的細(xì)胞位置(cellular component)、參與的生物過程(biological process)三部分分析差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能(圖3)。4個(gè)對(duì)比方案中，生物過程主要富集在代謝過程、細(xì)胞過程、單體過程、定位和刺激反應(yīng)，細(xì)胞組分部分主要富集在細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞器、細(xì)胞器組分、膜、膜組分和高分子復(fù)合物，分子功能部分主要富集在結(jié)合物和催化活性。

圖3 差異基因GO功能富集分析

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG注釋及通路分析

通過對(duì)差異表達(dá)基因的通路注釋可以進(jìn)一步解釋基因的生物學(xué)功能，對(duì)4715個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG分析，選取顯著富集的前20個(gè)通路繪制散點(diǎn)圖(圖4)。臨麥2號(hào)葉片0 h－vs－臨麥2號(hào)葉片1 h之間差異顯著富集的通路主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、氧化磷酸化、內(nèi)吞作用、剪接體、核糖體、光合作用、氮代謝、谷胱甘肽代謝，臨麥2號(hào)葉片0 h－vs－菏麥13葉片0 h之間差異顯著富集的通路主要在谷胱甘肽代謝、苯并惡嗪酮類化合物生物合成、二羧酸代謝、檸檬烯和蒎烯降解、維生素B6代謝、油菜素內(nèi)酯的生物合成、二苯酚、二甲苯和姜二醇生物合成、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、異黃酮的生物合成、亞麻酸代謝、甘油磷脂代謝、苯丙素的生物合成、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、色氨酸代謝，臨麥2號(hào)葉片1 h－vs－菏麥13葉片1 h之間顯著富集的通路主要在代謝途徑、光合作用、氧化磷酸化、二羧酸代謝、谷胱甘肽代謝、亞麻酸代謝、油菜素內(nèi)酯的生物合成，菏麥13葉片0 h－vs－菏麥13葉片1 h之間差異顯著富集的通路主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、內(nèi)吞作用、剪接體、異黃酮生物合成、光合作用、氧化磷酸化、檸檬烯和蒎烯降解、二萜生物合成、核苷酸切除修復(fù)、亞油酸代謝、錯(cuò)配修復(fù)、DNA復(fù)制。

圖4 差異基因KEGG富集通路

2.6 差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄因子

對(duì)所有差異表達(dá)基因歸類，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子共有86個(gè)(表4)，屬于21個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，主要包含AP2－EREBP家族15個(gè)(上調(diào)10個(gè)，下調(diào)5個(gè))，MYB家族11個(gè)(上調(diào)4個(gè)，下調(diào)7個(gè))，NAC家族8個(gè)(上調(diào)4個(gè)，下調(diào)4個(gè))，WRKY家族12個(gè)(上調(diào)5個(gè)，下調(diào)7個(gè))，HSF家族7個(gè)(上調(diào)7個(gè))。

表4 差異表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目統(tǒng)計(jì)

3 討論與結(jié)論

植物對(duì)高溫的響應(yīng)是多基因控制的過程，為了明確小麥在全基因組水平上對(duì)高溫的響應(yīng)機(jī)制，本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)耐高溫小麥品種菏麥13和熱敏感品種臨麥2號(hào)在花后14 d 42℃高溫處理0、1 h，取旗葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，Q30比例在96%以上，表明測(cè)序質(zhì)量良好，保證了數(shù)據(jù)的可靠性，可以進(jìn)行后續(xù)分析。本研究共篩選出4715個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因數(shù)目為3040個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因數(shù)目為1675個(gè)。

3.1 不同品種在熱脅迫下差異基因的GO分析

通過差異表達(dá)基因的GO富集分析可知，4個(gè)比較方案在參與的生物過程和所處細(xì)胞位置方面主要富集在代謝過程和細(xì)胞。在高溫處理1 h后，臨麥2號(hào)葉片0 h－vs－臨麥2號(hào)葉片1 h、菏麥13葉片0 h－vs－菏麥13葉片1 h中刺激反應(yīng)富集的基因數(shù)目明顯較臨麥2號(hào)葉片0 h－vs－菏麥13葉片0 h多，說明某些基因在高溫條件下開始表達(dá)，對(duì)逆境做出響應(yīng)。在分子功能方面，臨麥2號(hào)葉片0 h－vs－臨麥2號(hào)葉片1 h和菏麥13葉片0 h－vs－菏麥13葉片1 h結(jié)合物富集基因較多，臨麥2號(hào)葉片0 h－vs－菏麥13葉片0 h和臨麥2號(hào)葉片1 h－vs－菏麥13葉片1 h則是催化活性富集較多，表明高溫脅迫下，基因以結(jié)合物的形式參與調(diào)控。臨麥2號(hào)葉片1 h－vs－菏麥13葉片1 h在膜上富集的基因數(shù)目較臨麥2號(hào)葉片0 h－vs－臨麥2號(hào)葉片1 h少了許多，這可能是耐熱品種與不耐熱品種之間的差異。

3.2 不同品種在熱脅迫下差異基因的KEGG分析

在KEGG 4種比較方案的分析中，臨麥2號(hào)葉片0 h－vs－臨麥2號(hào)葉片1 h和菏麥13葉片0 h－vs－菏麥13葉片1 h的差異基因顯著富集的通路主要集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、內(nèi)吞、光合作用、谷胱甘肽代謝、剪接體等方面。光合作用發(fā)生次數(shù)最多，表明高溫對(duì)光合作用的影響最大。光合速率的降低會(huì)阻礙同化物的運(yùn)輸，降低淀粉合成速率，導(dǎo)致小麥籽粒干癟，千粒重減少，從而影響產(chǎn)量[1]。當(dāng)高溫脅迫發(fā)生時(shí)，植物的耐高溫機(jī)制開始響應(yīng)，如熱激蛋白和熱激轉(zhuǎn)錄因子開始參與高溫脅迫，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工得到加強(qiáng)。內(nèi)吞作用是鈣離子進(jìn)入細(xì)胞的途徑之一，鈣離子在抵抗高溫脅迫方面也起著重要作用。有研究表明，在小麥葉片上噴灑一定濃度的CaCl2溶液可以有效提高小麥的耐熱性，提高小麥產(chǎn)量[17]。谷胱甘肽參與誘導(dǎo)多種熱激蛋白的表達(dá)，例如谷胱甘肽通過轉(zhuǎn)錄因子MYB21激活熱休克蛋白基因bip3和hsp70b啟動(dòng)子，通過轉(zhuǎn)錄因子BZIP10激活hsp90.1啟動(dòng)子[18，19]。

3.3 部分轉(zhuǎn)錄因子對(duì)熱脅迫的響應(yīng)

轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)胞響應(yīng)外界脅迫以后主要調(diào)控某些基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子。朱丹等[20]以薄荷為試驗(yàn)材料，在光照培養(yǎng)箱設(shè)置40℃模擬高溫脅迫處理2 h，采集葉片進(jìn)行高通量測(cè)序，其結(jié)果顯示與高溫脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族主要集中在NAC、AP2－EREBP、WRKY、MYB、HSF等轉(zhuǎn)錄因子家族；張春霄[21]在黃花苜蓿中克隆到AP2/EREBP家族的MfERF049基因，對(duì)該基因進(jìn)行了高溫、低溫、干旱、耐鹽等非生物脅迫且該基因?qū)ι鲜龇巧锩{迫做出響應(yīng)。李靜宇等[22]證實(shí)MYB基因上啟動(dòng)子區(qū)域含有多種脅迫和生物激素的響應(yīng)元件。NAC轉(zhuǎn)錄因子家族在調(diào)控包含高溫在內(nèi)的多種非生物脅迫時(shí)起到了非常重要的作用[23，24]。WRKY是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，具有一個(gè)或兩個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域[25]，與種子的休眠和萌發(fā)、作物的衰老和抵御逆境脅迫有關(guān)。HSF轉(zhuǎn)錄因子家族在對(duì)高溫的響應(yīng)中一直發(fā)揮著重要作用[26，27]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高溫脅迫下，小麥旗葉中的轉(zhuǎn)錄因子包括NAC、AP2－EREBP、WRKY、MYB、HSF。這與前人結(jié)果一致，表明這些轉(zhuǎn)錄因子在小麥應(yīng)對(duì)高溫脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。該結(jié)果為后續(xù)探索小麥高溫脅迫的分子機(jī)制及選育優(yōu)質(zhì)的耐高溫品種提供理論依據(jù)。