劉永新，陳 艷，李啟艷，王雨晴，來明名

（大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000）

肥胖已成為全球范圍內(nèi)常見的醫(yī)學(xué)社會(huì)問題，肥胖會(huì)導(dǎo)致許多疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)升高，如高血壓、2型糖尿病、心腦血管疾病等〔1-2〕。遺傳學(xué)認(rèn)為肥胖是基因和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。大量研究表明，大約65%的肥胖是可遺傳的，參與能量消耗或能量攝取的基因可能與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)〔3-4〕。

解偶聯(lián)蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）是一種位于線粒體內(nèi)膜的H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠?qū)+運(yùn)送至線粒體基質(zhì)，使氧化磷酸化解偶聯(lián)不產(chǎn)生三磷酸腺苷，而是轉(zhuǎn)化為熱能釋放出去〔5〕。UCP1在具有產(chǎn)熱功能的棕色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）中特異性高表達(dá)，主要功能是參與BAT的產(chǎn)熱調(diào)節(jié)來維持機(jī)體的能量代謝平衡〔6〕。在寒冷、腎上腺素或甲狀腺素等刺激下，BAT中的UCP1基因表達(dá)增加，從而刺激脂肪組織消耗更多能量來產(chǎn)生熱量。功能研究〔7〕發(fā)現(xiàn)，UCP1基因多態(tài)性能夠影響UCP1 mRNA表達(dá)水平，從而調(diào)控能量代謝平衡。UCP1基因-3826 A>G位于上游啟動(dòng)子區(qū)，這個(gè)位點(diǎn)的突變與肥胖和代謝紊亂相關(guān)聯(lián)。-3826 A>G位點(diǎn)突變可導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化水平降低，從而引起組織三酰甘油水平增加，高密度脂蛋白水平降低，低密度脂蛋白和膽固醇水平增加〔8〕。但在瑞典和西班牙人中開展的研究則未發(fā)現(xiàn)上述關(guān)聯(lián)〔9-10〕。這種差異可能是由于不同人群的基因背景不同、基因的連鎖不平衡或人群所處的環(huán)境不同所導(dǎo)致的。因此，該位點(diǎn)與肥胖之間的相關(guān)性仍需要在不同人群中加以驗(yàn)證。

體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI）是利用體質(zhì)量和身高來衡量人的胖瘦程度的一個(gè)重要指標(biāo)。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，BMI增高與肥胖、高血壓、糖尿病、代謝綜合征等疾病的發(fā)生密切相關(guān)〔11-12〕。因此，將BMI控制在正常范圍內(nèi)，有助于對(duì)肥胖及其相關(guān)代謝綜合征的預(yù)防。BMI易受外界因素的影響，如生活習(xí)慣、飲食習(xí)慣等，但遺傳因素對(duì)BMI的影響尚不太清楚。本研究以大理大學(xué)在校大學(xué)生為研究對(duì)象，通過計(jì)算個(gè)體BMI，檢測(cè)UCP1基因-3826 A>G位點(diǎn)多態(tài)性，探討該位點(diǎn)多態(tài)性與BMI的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本界定及采集從NCBI數(shù)據(jù)庫中查得UCP1基因-3826 A>G（rs1800592）位點(diǎn)平均突變率為33%，根據(jù)現(xiàn)況研究中有限總體的樣本量計(jì)算公式〔13〕：n1=z2α/2（1-P）P/δ2，n2=n1N/（N+n1），式中，P=33%為UCP1基因-3826 A>G位點(diǎn)G突變率，δ=5%為允許誤差，zα/2=1.96（α=0.05雙側(cè)），N=3 000為研究總體人群數(shù)量，計(jì)算得調(diào)查所需最小樣本量n2=305，最終共收集308例樣本。隨機(jī)選取2019年3月—2020年12月大理大學(xué)308例在校大學(xué)生作為研究對(duì)象，采集其口腔黏膜細(xì)胞。樣本采集前，告知受試者采樣目的，征得受試者本人知情同意后進(jìn)行樣本采集并登記其姓名、年齡、身高、體質(zhì)量及聯(lián)系方式。研究遵循的程序符合大理大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號(hào)：DP304）；Master Mix（LGC公司，批號(hào)：13116560）；超微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀（Thermo公司）；高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI公司）。

1.3 基因組DNA提取清水漱口清理口腔后，用消毒棉簽在受試者口腔內(nèi)壁刮取黏膜細(xì)胞，將取樣棉簽放入裝有500 μL 0.9%氯化鈉溶液的1.5 mL離心管中，振蕩混勻，10 000 r/min離心1 min，獲得口腔黏膜細(xì)胞沉淀，使用基因組DNA提取試劑盒，提取基因組DNA。

1.4 UCP1基因-3826 A>G位點(diǎn)多態(tài)性分型檢測(cè)采用競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）對(duì)所提取DNA樣本進(jìn)行基因分型檢測(cè)。根據(jù)UCP1基因SNP位點(diǎn)rs1800592（-3826 A>G）設(shè)計(jì)3條KASP標(biāo)記引物，包括2條正向特異性引物和1條反向通用引物，引物序列：正向引物（A）：GAAAATGTAGAACACATTAACAAA TGCACTT；正向引物（G）：AAAATGTAGAACACATT AACAAATGCACTC；反向引物：AGCGATTTCTGATT GACCACAGTTTGAT。反應(yīng)體系10 μL，包括4.78 μL DNA（20～50 ng/μL），5 μL 2×KASP Master Mix，0.14 μL KASP Assay Mix，0.08 μL Mg2+。KASP Assay Mix由3條引物稀釋獲得，按正向引物（A）（100 μmol/L）∶正向引物（G）（100 μmol/L）∶反向引物（100 μmol/L）∶重蒸水=12∶12∶30∶46混合而成。采用降落PCR進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序：94℃熱處理15 min；94℃變性20 s，61~55℃退火和延伸60 s，10個(gè)降落循環(huán)（每個(gè)循環(huán)降低0.6℃）；94℃變性20 s，55℃退火和延伸60 s，26個(gè)循環(huán)；4℃避光保存。PCR反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，每次反應(yīng)設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照組，其DNA模板用重蒸水代替，擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行基因分型分析。

1.5 BMI計(jì)算及分組測(cè)量受試者身高、體質(zhì)量，計(jì)算BMI，BMI=體質(zhì)量（kg）/身高（m）2。根據(jù)BMI，將樣本分為體質(zhì)量過輕（BMI<18.5 kg/m2）、體質(zhì)量正常（18.5 kg/m2≤BMI<24.0 kg/m2）、體質(zhì)量過重（24.0 kg/m2≤BMI<28.0 kg/m2）和肥胖（BMI≥28.0 kg/m2）4組。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以［n（%）］表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UCP1基因-3826 A>G位點(diǎn)多態(tài)性分布情況利用KASP技術(shù)對(duì)UCP1基因-3826 A>G位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行基因分型檢測(cè)，結(jié)果見圖1。隨機(jī)抽取30份樣本進(jìn)行一代（Sanger）測(cè)序，對(duì)KASP檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，顯示2種方法的基因分型結(jié)果完全一致。見圖2。AA基因型（野生型）64例（占20.8%），AG基因型（雜合變異型）216例（占70.1%），GG基因型（純合變異型）28例（占9.1%），AA、AG和GG基因型頻率分別為：0.21，0.70和0.09。其中，正常A基因頻率為0.56，突變G基因頻率為0.44。

2.2 UCP1基因-3826 A>G位點(diǎn)多態(tài)性與不同性別的相關(guān)性分析在308例受試者中，年齡18~21歲，男性96例（占31.2%），女性212例（占68.8%），不同性別受試者各基因型構(gòu)成比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 不同性別受試者3種基因型構(gòu)成比［n（%）］

2.3 UCP1基因-3826 A>G位點(diǎn)多態(tài)性與BMI的相關(guān)性分析308例受試者中體質(zhì)量過輕、體質(zhì)量正常、體質(zhì)量過重和肥胖人數(shù)所占比例分別為16.9%、79.2%、3.9%和0.0%，其中肥胖人數(shù)為0。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，與野生型AA攜帶者BMI（19.60±2.05）kg/m2相比，AG和GG基因型攜帶者BMI分別為（20.52±1.77）kg/m2和（20.95±2.69）kg/m2，顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對(duì)體質(zhì)量過輕組、體質(zhì)量正常組和體質(zhì)量過重組基因型頻率和等位基因頻率進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中，純合變異型GG基因型頻率和突變G等位基因頻率在體質(zhì)量過重組所占比例高于體質(zhì)量過輕組和體質(zhì)量正常組。見表2。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估顯示，與體質(zhì)量正常組相比，體質(zhì)量過重組GG基因型會(huì)使體質(zhì)量增加的風(fēng)險(xiǎn)增高3.875倍，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。以上結(jié)果表明，BMI較低者UCP1基因突變的頻率較低，而BMI較高者UCP1基因突變的頻率也較高，UCP1基因多態(tài)性與BMI存在一定的關(guān)聯(lián)性，且GG基因型會(huì)使體質(zhì)量增加的風(fēng)險(xiǎn)提高。

表2 UCP1-3826 A>G位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在不同人群中的分布［n（%）］

表3 體質(zhì)量正常組和體質(zhì)量過重組不同基因型風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估［n（%）］

3 討論

本研究隨機(jī)抽取大理大學(xué)在校大學(xué)生為研究對(duì)象，提取口腔黏膜脫落細(xì)胞基因組DNA，通過KASP技術(shù)對(duì)UCP1基因-3826 A>G位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行基因分型。研究發(fā)現(xiàn)，隨著BMI的增高該位點(diǎn)的突變頻率也逐漸增高，且純合變異型GG會(huì)使體質(zhì)量增加的風(fēng)險(xiǎn)增高3.875倍。結(jié)果提示，UCP1基因-3826 A>G位點(diǎn)多態(tài)性與BMI、肥胖具有一定的相關(guān)性。

UCP1主要位于BAT線粒體內(nèi)膜上，參與機(jī)體的產(chǎn)熱調(diào)節(jié)和能量代謝，具有抵制肥胖發(fā)生的作用〔14〕。因此，UCP1基因表達(dá)水平不同會(huì)對(duì)人體的能量代謝產(chǎn)生重大影響，而肥胖的本質(zhì)正是由機(jī)體能量攝入與消耗的不平衡導(dǎo)致的。Jorge等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，UCP1基因突變可以導(dǎo)致脂肪組織UCP1的mRNA表達(dá)水平下降，使肥胖的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。Sun等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)，UCP1基因-3826 A>G位點(diǎn)突變會(huì)使中國(guó)東北漢族人群原發(fā)性高血壓的患病風(fēng)險(xiǎn)增加。本研究發(fā)現(xiàn)，UCP1基因-3826 A>G位點(diǎn)多態(tài)性與體質(zhì)量、BMI之間存在相關(guān)性，純合變異基因型GG在體質(zhì)量過重組所占比例明顯高于體質(zhì)量過輕組和體質(zhì)量正常組，并且突變等位基因G的出現(xiàn)頻率隨著BMI的增加而增高。由于BMI是評(píng)價(jià)人胖瘦的重要指標(biāo)之一，本研究結(jié)果提示UCP1基因-3826 A>G位點(diǎn)多態(tài)性可能會(huì)導(dǎo)致肥胖的發(fā)生，與Jorge等〔15〕的研究結(jié)果類似。有研究〔17-18〕發(fā)現(xiàn)，UCP1基因啟動(dòng)子區(qū)域還存在其他位點(diǎn)多態(tài)性與疾病易感性相關(guān)，例如-1766 A>G和-112 A>C。Kim等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)，-1766 A>G位點(diǎn)多態(tài)性與韓國(guó)人群體脂積累有關(guān)，突變基因型AG和GG的腰臀比、體脂質(zhì)量、體脂比例均顯著高于AA型。Fukuyama等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，-112 A>C位點(diǎn)突變會(huì)引起胰島素抵抗，增加日本人群對(duì)2型糖尿病的易感性。然而，這些位點(diǎn)是否會(huì)通過相互作用影響疾病的發(fā)生目前仍然不是很清楚，這也將是以后研究的一個(gè)重點(diǎn)。

本次研究對(duì)象為在校大學(xué)生，年齡偏小且都是健康人群，在樣本統(tǒng)計(jì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，體質(zhì)量正常的人群所占比例明顯高于體質(zhì)量過輕或過重人群，肥胖人群在此次隨機(jī)選取的樣本中沒有發(fā)現(xiàn)，可能會(huì)對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果有一定的影響。后續(xù)將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量或選取不同年齡段的人群進(jìn)一步進(jìn)行研究，闡明UCP1基因-3826 A>G位點(diǎn)多態(tài)性與肥胖之間的關(guān)系，有助于人們更深入了解肥胖的發(fā)病機(jī)制，探索增加能量消耗的減肥新方法，使UCP1成為潛在的重要藥物靶點(diǎn)。