張慧珍

（譜尼測試集團股份有限公司，北京 100194）

李斯特氏菌屬隸屬革蘭氏陽性細菌中厚壁菌門，李斯特氏菌屬可劃分為6個菌種，即單核增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）、英諾克李斯特氏菌（L. innocua）、斯氏李斯特氏菌（L. seeligeri）、威爾斯特氏菌（L. welshimeri）、伊氏李斯特菌（L. ivanovii）和格氏李斯特菌（L. grayi）[1]。在這6個菌種中只有單核增生李斯特和伊氏李斯特氏菌可以引起動物發(fā)病，其中通常只有單核增生李斯特氏菌和人類的李斯特氏菌癥相關。單核細胞增生李斯特菌是一種人畜共患病的病原菌，能引起人畜的李氏桿菌病，人畜感染后主要表現(xiàn)為腦膜炎、敗血癥和單細胞增多，尤以妊娠期婦女，新生兒及免疫功能低下的病人更易感染。因此，李斯特氏菌中最具檢測意義的是單核增生李斯特氏菌。

單核細胞增生李斯特氏菌廣泛分布于自然界，如土壤、屠宰場、食品生產加工器具和多種食品中，動物或人體也帶有此菌。食品中存在的單核細胞增生李斯特氏菌對人類的身體健康極具危害，該菌在 4 ℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。

當前對單核細胞增生李斯特氏的檢測方法主要有傳統(tǒng)檢測方法、環(huán)介導等溫擴增反應（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）[2]、以聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）為基礎的分子生物學技術等[3-4]。隨著科技不斷發(fā)展，針對食源性致病菌的檢測技術也越來越多，新興的檢測方法具有檢測周期短、成本高等特點，而大多數食品生產、食品流通企業(yè)仍會選擇低成本的傳統(tǒng)的國家標準檢測方法。想要得到精準的檢測結果，新興的檢測方法依賴于試驗設備，而傳統(tǒng)的檢測方法更依賴于人員的經驗，因此采用傳統(tǒng)的方法檢測單增李斯特氏菌對試驗員提出了更高的要求。

1 目的和意義

本文主要從試劑準備、增菌、劃線分離及生化鑒定等方面闡述了對單核細胞增生李斯特檢測的一些理解，以期為檢測人員依據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》（GB 4789.30—2016）進行食品中單增李斯特氏菌檢測提供參考，減少人為因素造成的漏判或漏檢。

2 國家標準檢測方法GB 4789.30—2016的探討

食品中單核細胞增生李斯特氏菌檢測需進行増菌、分離、初篩和鑒定4個連續(xù)過程。

2.1 增菌

食品經常同時受到多種致病菌污染，為提高對應致病菌的檢出率，樣品檢測前需先進行抑菌和增菌過程。例如，將檢驗樣品25 g（mL）加入到含有 225 mL LB1增菌液中，均質，（30±1）℃培養(yǎng)24 h，移取0.1 mL，轉種于10 mL LB2增菌液內，于（30±1）℃培養(yǎng)18～24 h。此過程中，增菌液中的萘啶酮酸和吖啶黃通過抑制細菌脫氧核苷酸的合成機理對革蘭氏陰性菌和鏈球菌起到了抑制作用，同時由于單增李斯特具有耐冷特性，通過低溫培養(yǎng)使其快速繁殖生長，便于檢出[5]。在進行增菌操作步驟時，應該注意以下問題。

（1）在配制LB1、LB2基礎培養(yǎng)基時，應先將李氏增菌基礎培養(yǎng)基按照配制比例加熱溶解，再進行高溫高壓滅菌，以防培養(yǎng)基受熱不均勻，破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分。

（2）配制好的LB1、LB2使用前再按要求量加入萘啶酮酸和吖啶黃素。萘啶酮酸對光較敏感，因此要注意避光保存且LB1、LB2最好現(xiàn)用現(xiàn)添加。吖啶黃素有一定的致癌性，在使用過程中要注意打開安瓿瓶時動作要輕柔，必要時可以用砂輪多摩擦幾次瓶頸處，然后再輕輕掰開，以免液體濺出接觸到試驗人員。

（3）從培養(yǎng)后的LB1中移取0.1 mL轉接到10 mL LB2中，因轉接量較小、增菌液不均等原因，容易造成漏檢，應先將LB1充分混合均勻。在混勻過程中，避免產生大量對人體有害的氣溶膠，通過眼鼻黏膜或者吸入方式感染試驗人員或污染環(huán)境，在整個檢測過程中應嚴格注意無菌操作、動作輕柔及生物安全，并做好人員防護。

2.2 分離

根據國家標準方法，為從增菌液中分離出獨立的目標菌，取LB2二次增菌液劃線接種于PALCAM瓊脂平板和李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上，于（36±1）℃培養(yǎng)24～48 h，觀察各個平板上生長的菌落。典型菌落在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。典型菌落在柯瑪嘉顯示培養(yǎng)基上呈現(xiàn)藍色菌落，有白色暈環(huán)。

李斯特顯色培養(yǎng)基增補劑的添加及注意事項有以下幾點。①增補劑需在基礎培養(yǎng)基滅菌后，倒平皿前根據每次基礎培養(yǎng)基的配制量添加，在添加前無滅菌過程，所以在稱取及配制過程中一定要非常注意無菌操作，以免造成增補劑的污染，致使培養(yǎng)基的大量浪費，稱取后嚴格按照無菌要求密封增補劑以便后期使用。②單增李斯特和其他的李斯特菌有相似的生長特性，它們在傳統(tǒng)的培養(yǎng)基上不易被區(qū)分，而李斯特顯色培養(yǎng)基上可以通過白色暈環(huán)來區(qū)分，因此白色暈環(huán)對于區(qū)分單增李斯特和其他李斯特菌具有指導意義。但有時單增李斯特在李顯培養(yǎng)基上無白色暈環(huán)，通過陽性菌對照試驗發(fā)現(xiàn)如果增補劑不夠均勻或配制好的平皿保存不當均可能出現(xiàn)無白色暈環(huán)問題。所以增補劑在配制過程中一定要攪拌均勻，使其完全溶解，最終成為奶油狀的均質溶液，避免在顯色培養(yǎng)基中出現(xiàn)很多絮狀凝塊，造成應有的白色暈環(huán)不明顯，甚至不出現(xiàn)，故在試驗過程中采用陽性對照菌株驗證培養(yǎng)基尤為 重要。

2.3 初篩

自選擇性瓊脂平板上分別挑取5個以上典型或可疑菌落，分別接種在木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于（36±1）℃培養(yǎng)24 h；同時在TSA-YE平板上劃線純化，于（30±1）℃培養(yǎng)24～48 h。選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進行鑒定。關于初篩過程選菌問題有以下幾點建議。

（1）從不同角度觀察平皿上的菌落。因GB 4789.30— 2016中規(guī)定選擇兩種選擇性培養(yǎng)基，在大量的試驗中發(fā)現(xiàn)，李斯特顯色培養(yǎng)基的區(qū)分度很高，首先選擇在李顯上呈現(xiàn)藍色菌落，帶白色暈圈的菌做初篩，這樣可減少部分試驗室工作。在選菌時，一定注意要從不同角度觀察平皿上的菌落，避免因為光線角度或者菌落生長狀態(tài)問題，而未發(fā)現(xiàn)帶有白色暈圈的菌落。同時李顯的培養(yǎng)時間也很重要，有些菌株在培養(yǎng)24 h時呈現(xiàn)藍色菌落，但無白色暈圈，隨著培養(yǎng)時間的加長，白色暈圈才會出現(xiàn)，48 h時會很明顯。因此，李斯特顯色培養(yǎng)基需培養(yǎng)24～48 h。若培養(yǎng)48 h后李顯培養(yǎng)基上無帶暈圈菌落，則再從PALCAM培養(yǎng)基上進行選擇。

（2）選擇較大菌落。初次篩選從一個菌落上既接生化，又進行劃線純化確實存在困難，初篩最好選擇較大菌落?？紤]到單增李斯特氏菌菌體較小，培養(yǎng)24～48 h后可達到1～2 mm，建議先將可疑菌落做平板劃線純化，然后再進行生化鑒定。為節(jié)約檢測時間，李顯培養(yǎng)基上的典型菌落可將純化平皿和其他鑒定試驗一起進行。

2.4 鑒定

在單增李斯特氏菌國家標準檢測方法中鑒定包括鏡檢、動力試驗、生化鑒定、溶血試驗和協(xié)同溶血試驗。這些鑒定方式在單增檢測中溶血試驗和協(xié)調溶血試驗既是關鍵試驗也是難點。

（1）鏡檢、生化試驗。一般無論是PALCAM還是李斯特顯色培養(yǎng)基出現(xiàn)可疑菌落，鏡檢時菌體大都符合李斯特菌特點，李斯特氏菌呈小的、類似球形的革蘭氏陽性桿菌，呈短鏈，在營養(yǎng)不良培養(yǎng)基中可形成絲狀[6]。若在PALCAM或李斯特顯色培養(yǎng)基上未呈現(xiàn)可疑菌落，不能進行初篩，一般可進一步通過生化試驗，如過氧化氫酶試驗、MR-VP試驗等，進行排除。若菌落呈陽性反應，則為李斯特 氏菌。

（2）溶血試驗。將羊血瓊脂平板底面劃分為20～25個小格，挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落刺種到血平板上，每格刺種一個菌落，并刺種陽性對照菌(單增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌)和陰性對照菌(英諾克李斯特氏菌)，穿刺時盡量接近底部，但不要觸到底面，同時避免瓊脂破裂，（36±1）℃培養(yǎng)24～48 h，于明亮處觀察，單增李斯特氏菌呈現(xiàn)狹窄、清晰、明亮的溶血圈，斯氏李斯特氏菌在刺種點周圍產生弱的透明溶血圈，英諾克李斯特氏菌無溶血圈，伊氏李斯特氏菌產生寬的、輪廓清晰的β-溶血區(qū)域。若結果不明顯，可置于 4 ℃冰箱24～48 h后再觀察。在實際工作中，由于單增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌產生的狹小的β溶血環(huán)很難觀察，經大量穿刺不同厚度的血平板試驗發(fā)現(xiàn)，在瓊脂厚度1～1.5 mm的血平板上穿刺更有利于觀察溶血現(xiàn)象，且僅需培養(yǎng)24 h。通過調整血平板厚度，極大方便了試驗員的觀察。血平板中培養(yǎng)基較薄，穿刺時會觸及底面，但這并不影響觀察狹小的β溶血，因為若菌體無溶血，被接種針穿透處會被菌體填滿，狹小的β溶血會在原穿透位置四周部分溶血，而伊氏李斯特氏菌則會出現(xiàn)較大的溶血環(huán)。

（3）協(xié)同溶血試驗。此試驗的關鍵點是金黃色葡萄球菌的菌株類型，并不是所有金黃色葡萄球菌都能參與此試驗。GB 4789.30—2016中明確規(guī)定所用金黃色葡萄球菌菌株編號為ATCC 25923，試驗嘗試用ATCC 6538代替ATCC 25923，最終沒有出現(xiàn)協(xié)同溶血現(xiàn)象。另外，協(xié)同溶血試驗所用菌株，最好選用相應選擇性平板上的單個菌落，不要選擇新鮮培養(yǎng)的菌懸液，這樣既能保證菌株未被污染，也能防止菌懸液非肉眼可見的散落對試驗現(xiàn)象的干擾。在此協(xié)同溶血試驗中，對于血平板的薄厚要求不高，血平板略薄，培養(yǎng)不足24 h即可觀察到協(xié)同溶血 現(xiàn)象。

（4）溶血試驗。溶血試驗中血液一定要新鮮，尤其是單增李斯特菌的狹小的β溶血試驗，如果血液不新鮮，觀察不到狹小的β溶血，容易造成誤判斷。建議血平板現(xiàn)配現(xiàn)用，并且最好不要放入電熱恒溫培養(yǎng)箱中除水汽，這樣對紅血球有一定的破壞性，致使后續(xù)溶血試驗現(xiàn)象不能出現(xiàn)應有的試驗現(xiàn)象，觀察結果出現(xiàn)偏差，造成錯判或者漏判。

（5）動力試驗。穿刺半固體或者SIM動力培養(yǎng)基，培養(yǎng)基容器應為小的玻璃試管，培養(yǎng)基的量應在試管1/3處較合適，培養(yǎng)基試驗前最好放入培養(yǎng)箱適當去除水分，以免接種時有水汽，影響試驗現(xiàn)象的觀察。穿刺時所用接種針要比較平直，穿刺過程中手部動作要保持平穩(wěn)，不要出現(xiàn)抖動，可以在穿刺時將接種針的接種桿貼著試管壁，以保證穿刺的 平穩(wěn)。

2.5 結果報告

結合生化試驗和溶血試驗結果，報告25 g（mL）樣品中檢出或未檢出單核細胞增生李斯特氏菌。

3 結語

本文均是對GB 4789.30—2016檢測方法的一些理解和日常檢測經驗的概述，旨在通過對每個檢測步驟關鍵點的分析，避免人為因素引起的錯判和漏判。同時，希望能夠給試驗人員提供比較詳細的檢測經驗，以便更高效地判斷試驗現(xiàn)象與試驗結果，保證數據的準確性。