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        lncRNA-GAS5/miRNA21 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡在高氧性急性肺損傷發(fā)病過程中的作用研究①

        2022-11-16 03:16:58廖貞亮遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科遵義563000
        中國免疫學雜志 2022年18期
        關鍵詞:水平模型

        石 磊 付 豹 何 英 廖貞亮 陳 濤 陳 淼(遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科,遵義 563000)

        高氧性急性肺損傷(hyperoxia-induced acute lung injury,HALI)是氧療最典型的并發(fā)癥,可進一步發(fā)展為成人急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)及新生兒支氣管肺發(fā)育不良,是導致患者死亡及新生兒支氣管發(fā)育不良的主要原因之一[1-2]。肺泡上皮細胞參與肺組織免疫調(diào)節(jié)、肺水轉運、肺泡表面活性物質合成分泌、增殖、分化和修復等過程。研究表明,高氧可導致肺泡上皮細胞凋亡,促進HALI發(fā)生發(fā)展[3]。微小RNAs(miRNAs)是一組由18~25個核苷酸組成的高度保守的非編碼單鏈RNAs,長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一組不具有編碼蛋白質能力的功能性長鏈RNA,兩者參與多種疾?。ò毙苑螕p傷)發(fā)病過程[4-5]。研究表明,miR-21在HALI進展中表達下調(diào),且miR-21可抑制大鼠肺泡上皮細胞早期凋亡,采用慢病毒過表達miR-21能夠顯著改善大鼠HALI[6-7]。近年研究發(fā)現(xiàn),lncRNA能夠作為競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA,一個RNA可調(diào)節(jié)多個靶基因,同一個靶基因可被不同RNA調(diào)節(jié),調(diào)控同一靶點RNA間構成競爭關系)吸附miRNAs,上調(diào)miRNA靶基因表達,發(fā)揮生物學功能。研究表明,lncRNA-GAS5能夠通過負調(diào)節(jié)細胞內(nèi)miR-21水平從而調(diào)控miR-21對靶基因的抑制[8-10]。因此推測HALI發(fā)病過程中miR-21水平可能受lncRNA-GAS5調(diào)節(jié)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 實驗動物SPF級雄性SD大鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,體質量約200 g,許可證號:SCXK(京)2019-0009。

        1.1.2 主要試劑 慢病毒載體由北京博恒科創(chuàng)生物科技有限公司制備;IL-1β、IL-6、TNF-αELISA試劑盒購于R&D system公司;AnnexinⅤ-PI凋亡染色試劑盒購于美國BD公司;抗大鼠GAPDH、IκBα、NF-κB p65、Lamin B1抗體均購于Abcam公司。

        1.2 方法

        1.2.1 動物干預方式SD大鼠隨機分為空白組(n=6)、模型組(n=12)、lncRNA組(n=12)和lncRNA聯(lián)合miRNA組(n=12),所有大鼠采用異氟烷麻醉,空白組不做任何處理,模型組靜脈注射200μl慢病毒空載體(6×106TU/ml,飽和轉染劑量),lncRNA組靜脈注射200μl lncRNA-GAS5過表達慢病毒載體(6×106TU/ml),lncRNA聯(lián) 合miRNA組 靜 脈 注 射200μl lncRNA-GAS5過表達慢病毒載體(6×106TU/ml)和200μl miR-21過表達慢病毒載體(6×106TU/ml),轉染72 h(飽和轉染時間)后,模型組、lncRNA組和lncRNA聯(lián)合miRNA組大鼠給予高氧處理,建立HALI模型:自制高氧箱(45 cm×30 cm×35 cm的有機玻璃容器,頂端開孔接氧氣接頭,側面有等大出氣孔,可接氧氣檢測儀),將SD大鼠置于高氧箱中飼養(yǎng),25~27℃,50%~70%濕度,箱內(nèi)氧濃度持續(xù)≥90%,箱內(nèi)放置鈉石灰吸收大鼠呼出的CO2,保持箱內(nèi)CO2濃度<0.5%,23.5 h/d持續(xù)給氧,上午定時開艙0.5 h添加食物、水以及更換墊料[11]。

        1.2.2 呼吸指標檢測 高氧處理48 h后取大鼠動脈血檢測,分析氧合指數(shù)(oxygenation index,OI)和呼吸指數(shù)(respiration index,RI)。OI=PaO2/FiO2,其中PaO2為動脈氧分壓,F(xiàn)iO2為吸入氧濃度,本研究FiO2均記為90%。RI=P(A-a)O2/PaO2,其中P(A-a)O2為肺泡-動脈血氧分壓差,PaO2為動脈血氧分壓。

        1.2.3 肺組織病理及濕/干重比(W/D)分析 高氧處理48 h后麻醉處死各組大鼠,取大鼠右肺組織,10%甲醛固定24 h,脫水,石蠟包埋,制備石蠟切片,進行HE染色。每只大鼠隨機選取20個高倍視野(×400),采用Gustavo Matute-Bello等評分系統(tǒng)進行獨立評分。按照肺泡及肺泡間質中性粒細胞個數(shù)、透明膜個數(shù)、蛋白碎片填充個數(shù)及肺泡間隔厚度進行評分,并取評分平均值。取大鼠左肺,快速去除周圍結締組織,濾紙擦干組織表面水分稱重,記為肺濕重(W),將肺組織80℃烘烤,每日稱重至恒重,記為肺干重(D),計算肺W/D。

        1.2.4 血漿細胞因子水平檢測 高氧處理48 h后麻醉各組大鼠,取各組大鼠外周血,離心分離血漿,ELISA檢測各組大鼠血漿IL-1β、IL-6、TNF-α水平,參照IL-1β、IL-6、TNF-αELISA試劑盒說明書操作。

        1.2.5 肺組織細胞凋亡分析 取20 mg左肺組織,0.25%胰酶+0.1%Ⅰ型膠原酶1∶1混合后注入肺組織,快速剪碎,放入搖床,150 r/min、37℃消化18 min,等體積終止液終止消化,并加入5 ml DNaseⅠ防止細胞成團,200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾,收集濾液,離心,棄上清,紅細胞裂解液重懸沉淀,室溫靜置1 min,等體積2×EDTA終止,離心,棄上清,收集沉淀,即得到肺組織細胞(主要由肺泡上皮細胞和巨噬細胞組成)。AnnexinⅤ-PI凋亡染色試劑盒對分離的細胞進行染色,流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

        1.2.6 RT-PCR高氧處理48 h后麻醉處死各組大鼠,取大鼠右肺組織,采用Trizol法提取海馬中RNA,反轉錄得到cDNA,RT-PCR檢測海馬組織細胞因子lncRNA-GAS5、miR-21、IL-1β、IL-6、TNF-α RNA表達。lncRNA-GAS5正向引物:5'-ATTTCAAGGGCTCCTCT-3',反向引物:5'-TTGGCAAATCTTCTGTTC-3';miR-21正向引物:5'-TGTACCACCTTGTCGG-3',反向引物:5'-TGCTGTTGCCATGAGAT-3';IL-1β正向引物:5'-GATGTCGAGAGTCCCAATGA-3',反向引物:5'-GCTGGCATTCTGAGGCAAAA-3';IL-6正 向 引 物:5'-GATTAGCCGAGGTATAGCCA-3',反向引物:5'-ACTTGGAGCTTCGGACAAGA-3';TNF-α正向引物:5'-GGCTAATTCAGTTAGGCGGC-3',反向引物:5'-CGGAGGACTTTGTAATGCAC-3';GAPDH正向引物:5'-CGTATCGGACGCCTGGTT-3',反向引物:5'-CGTGGGTAGAGTCATACTGGAAC-3'。

        1.2.7 Western blot高氧處理48 h后麻醉處死各組大鼠,取大鼠右肺組織,RIPA裂解液對組織進行裂解,Western blot檢測裂解液中IκBα磷酸化及細胞核內(nèi)NF-κB p65核積累量。

        1.3 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad 8.0軟件進行統(tǒng)計學分析,計量資料(xˉ±s)先進行正態(tài)檢驗,若服從正態(tài)分布,兩組間比較采用獨立t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析;若不服從正態(tài)分布,則選擇非參數(shù)秩和檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 HALI大鼠肺組織lncRNA-GAS5和miR-21表達RT-PCR結果顯示,模型組大鼠肺組織lnc-RNA-GAS5表達顯著高于空白組,而miR-21表達顯著低于空白組(P<0.01);lncRNA組大鼠肺組織lncRNA-GAS5表達顯著高于模型組和空白組,而miR-21表達顯著低于模型組和空白組(P<0.01);lncRNA聯(lián)合miRNA組大鼠肺組織lncRNA-GAS5和miR-21表達均顯著高于模型組和空白組(P<0.01,表1)。

        表1 HALI大鼠肺組織lncRNA-GAS5和miR-21表 達(±s)Tab.1 lncRNA-GAS5 and miR-21 expressions in lung tissue of HALI rats(±s)

        表1 HALI大鼠肺組織lncRNA-GAS5和miR-21表 達(±s)Tab.1 lncRNA-GAS5 and miR-21 expressions in lung tissue of HALI rats(±s)

        Note:Compared with control group,1)P<0.01;compared with model group,2)P<0.01.

        Groups Control Model lncRNA lncRNA+miRNA lncRNA-GAS5 1.02±0.08 2.55±0.331)12.37±2.911)2)11.72±2.871)2)miR-21 1.08±0.05 0.77±0.081)0.54±0.061)2)10.11±2.251)2)

        2.2 各組大鼠呼吸指標及肺W/D相比于空白組,模型組大鼠OI顯著降低,RI和W/D顯著升高(P<0.01);相比于模型組,lncRNA組大鼠OI顯著降低,RI和W/D顯著升高(P<0.01);相比于lncRNA組,lncRNA聯(lián)合miRNA組大鼠OI顯著升高,RI和W/D顯著降低(P<0.05),接近模型組水平(表2)。

        表2 各組大鼠呼吸指標及肺W/D(±s)Tab.2 Respiratory indexes and lung W/D of rats in each group(±s)

        表2 各組大鼠呼吸指標及肺W/D(±s)Tab.2 Respiratory indexes and lung W/D of rats in each group(±s)

        Note:Compared with control group,1)P<0.01;compared with model group,2)P<0.01;compared with lncRNA group,3)P<0.01.

        Groups Control Model lncRNA lncRNA+miRNA OI/mmHg 381.91±36.77 268.83±31.681)192.46±29.591)2)255.06±31.931)3)RI 0.16±0.05 0.38±0.101)0.59±0.111)2)0.41±0.091)3)W/D 3.62±0.31 4.49±0.421)5.26±0.491)2)4.57±0.431)3)

        2.3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平 與空白組相比,模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,lncRNA組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.01);與lncRNA組 相 比,lncRNA聯(lián) 合miRNA組 大 鼠 血 清IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低(P<0.01,表3),接近模型組水平。

        表3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平(±s,ng/L)Tab.3 Serum levels of IL-1β,IL-6 and TNF-αof rats in each group(±s,ng/L)

        表3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平(±s,ng/L)Tab.3 Serum levels of IL-1β,IL-6 and TNF-αof rats in each group(±s,ng/L)

        Note:Compared with control group,1)P<0.01;compared with model group,2)P<0.01;compared with lncRNA group,3)P<0.01.

        Groups Control Model lncRNA lncRNA+miRNA IL-1β 6.47±1.12 14.06±3.181)21.73±4.251)2)15.26±3.881)3)IL-6 22.24±7.24 47.74±10.871)69.86±14.161)2)49.02±11.621)3)TNF-α 40.70±14.33 80.60±21.851)117.73±26.381)2)82.12±25.751)3)

        2.4 各組大鼠肺組織病理 與空白組相比,模型組大鼠肺間質中性粒細胞顯著增多、肺泡間隔明顯增厚、病理評分顯著升高(P<0.01);與模型組相比,lncRNA組大鼠肺間質中性粒細胞顯著增多、肺泡間隔明顯增厚及病理評分升高更為顯著(P<0.01);與lncRNA組相比,lncRNA聯(lián)合miRNA組大鼠肺間質中性粒細胞、肺泡間隔明顯增厚及病理評分顯著改善(P<0.01,圖1)。

        圖1 各組大鼠肺組織病理變化Fig.1 Pathological changes of lung tissues in each group

        2.5 各組大鼠肺組織凋亡細胞數(shù) 流式細胞術結果顯示,與空白組相比,模型組大鼠肺組織凋亡細胞數(shù)顯著增多(P<0.01);與模型組相比,lncRNA組大鼠凋亡細胞數(shù)顯著增多(P<0.01);與lncRNA組相比,lncRNA聯(lián)合miRNA組大鼠肺組織凋亡細胞數(shù)顯著減少(P<0.01,圖2)。

        圖2 各組大鼠肺組織細胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis in lung tissue of rats in each group

        2.6 各組大鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達 與空白組相比,模型組大鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達顯著升高(P<0.01);與模型組相比,lncRNA組大鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達顯著升高(P<0.01);與lncRNA組相比,lncRNA聯(lián)合miRNA組大鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達顯著降低(P<0.01,表4),接近模型組水平。

        表4 各組大鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平(±s)Tab.4 IL-1β,IL-6 and TNF-αmRNA levels of rats in each group(±s)

        表4 各組大鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平(±s)Tab.4 IL-1β,IL-6 and TNF-αmRNA levels of rats in each group(±s)

        Note:Compared with control group,1)P<0.01;compared with model group,2)P<0.01;compared with lncRNA group,3)P<0.01.

        Groups Control Model lncRNA lncRNA+miRNA IL-1β 0.97±0.06 3.87±1.161)5.69±1.631)2)3.96±1.281)3)IL-6 1.02±0.04 6.78±1.921)11.79±2.531)2)7.01±2.311)3)TNF-α 1.04±0.08 10.03±2.671)18.61±4.061)2)10.73±3.121)3)

        2.7 各組大鼠肺組織NF-κB通路激活水平Western blot結果顯示,與空白組相比,模型組大鼠肺組織IκBα磷酸化及細胞核內(nèi)NF-κB p65水平顯著升高(P<0.01);與模型組相比,lncRNA組大鼠肺組織IκBα磷酸化及細胞核內(nèi)NF-κB p65水平顯著升高(P<0.01);與lncRNA組相比,lncRNA聯(lián)合miRNA組大鼠肺組織IκBα磷酸化及細胞核內(nèi)NF-κB p65水平顯著降低(P<0.01,圖3)。

        圖3 各組大鼠肺組織NF-κB通路激活水平Fig.3 Activation level of NF-κB pathway in lung tissues of rats in each group

        3 討論

        miR-21是一種抗細胞凋亡基因,在細胞凋亡發(fā)生發(fā)展中起重要作用,在HALI動物模型及肺泡上皮細胞損傷模型中表達顯著降低。進一步實驗證明,miR-21能夠通過抑制肺泡上皮細胞中PTEN蛋白表達抑制肺泡上皮細胞凋亡,改善HALI[6-7]。miR-21參與HALI發(fā)生發(fā)展,但其特定的ceRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡涉及的分子機制尚不明確。

        近年lncRNA-GAS5已成為ceRNA調(diào)控基因的研究熱點。研究發(fā)現(xiàn),人和鼠骨骼肌分化過程中,lncRNA可競爭性結合miRNA,調(diào)控miRNA及其靶基因表達,同時也受miRNA調(diào)控[12]。lncRNA-GAS5是一種在哺乳動物細胞生長和凋亡過程中起關鍵調(diào)控作用的lncRNA。研究顯示,乳腺腫瘤患者miR-21與lncRNA-GAS5表 達 呈 負 相 關,lncRNAGAS5是miR-21的負調(diào)節(jié)因子,可調(diào)節(jié)骨關節(jié)炎發(fā)展過程中軟骨細胞存活[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn),HALI大鼠肺組織中l(wèi)ncRNA-GAS5表達顯著升高;miR-21水平顯著下降,與既往研究結果一致。提示lnc-RNAGAS5/miRNA21 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡可能參與HALI發(fā)病過程。

        通過慢病毒感染大鼠使大鼠體內(nèi)高表達lnc-RNA-GAS5或miR-21,給予48 h持續(xù)高氧處理,觀察大鼠呼吸指標及組織病理變化。OI反映肺部氧合功能,與肺損傷呈負相關;RI反映肺部氣體交換功能,與肺功能呈正相關[13]。W/D反映肺泡毛細血管膜通透性變化,通透性改變是急性肺損傷病理生理學的重要參數(shù)之一。研究發(fā)現(xiàn),高氧處理的大鼠出現(xiàn)明顯急性肺損傷癥狀,表現(xiàn)為OI顯著降低,RI、肺W/D、病理評分、肺組織凋亡細胞數(shù)增多,而體內(nèi)過表達lncRNA-GAS5大鼠OI水平顯著低于模型組大鼠,RI、肺W/D、病理評分、肺組織凋亡細胞數(shù)顯著高于模型組大鼠,表明lncRNA-GAS5能夠加劇急性肺損傷。進一步發(fā)現(xiàn),過表達miR-21能夠逆轉過表達lncRNA-GAS5介導的HALI,表明lncRNA-GAS5通過抑制miR-21表達促進HALI。

        炎癥細胞,如中性粒細胞浸潤及炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α等)的分泌是HALI發(fā)病的重要原因[14]。本研究發(fā)現(xiàn),HALI模型組大鼠外周血IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白水平及肺組織IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達相比于健康大鼠顯著升高,而單獨過表達lncRNA-GAS5大鼠體內(nèi)IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA及蛋白水平相比于模型組進一步升高,而同時過表達lncRNA-GAS5和miR-21的大鼠體內(nèi)IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA及蛋白水平顯著低于單獨過表達lncRNA-GAS5大鼠,且其水平接近模型組大鼠,提示lncRNA-GAS5/miR-21調(diào)控網(wǎng)絡可能通過調(diào)控機體炎癥反應調(diào)節(jié)肺損傷。NF-κB信號通路在炎癥反應中扮演核心角色,控制轉錄DNA、細胞因子產(chǎn)生。靜息狀態(tài)下NF-κB與IκB結合,分布于細胞漿,機體受到刺激后,IκB發(fā)生磷酸化,磷酸化的IκB與NF-κB分離,NF-κB分子進入核內(nèi)調(diào)控生物學活動[15]。NF-κB信號通路在HALI發(fā)病過程扮演重要角色[16]。本研究發(fā)現(xiàn),HALI模型組大鼠肺組織IκBα磷酸化及細胞核內(nèi)NF-κB p65水平顯著高于健康大鼠,單獨過表達lncRNA-GAS5的大鼠肺組織IκBα磷酸化及細胞核內(nèi)NF-κB p65水平相比于模型組進一步升高,而同時過表達lncRNA-GAS5和miR-21的 大 鼠 肺 組 織IκBα磷 酸 化 及 細 胞 核 內(nèi)NF-κB p65水平顯著低于單獨過表達lncRNA-GAS5的大鼠,且其水平接近模型組。表明lncRNA-GAS5/miR-21 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡可能通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路激活調(diào)節(jié)HALI發(fā)生發(fā)展。

        綜上,lncRNA-GAS5/miR-21參與HALI發(fā)病過程,lncRNA-GAS5通過負調(diào)節(jié)miR-21表達,間接激活NF-κB通路,促發(fā)HALI。本研究明確了lncRNAGAS5/miR-21 ceRNA在HALI中的調(diào)控機制,可通過開發(fā)以lncRNA-GAS5或miR-21為靶點的藥物為HALI防治提供新方法。

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