林思涵 王 酉 狄 文 （上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海市婦科腫瘤重點實驗室，癌基因及相關基因國家重點實驗室，上海 200127）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及多器官臟器的慢性自身免疫性疾病，其以免疫系統(tǒng)失調(diào)，大量自身抗體產(chǎn)生以及免疫復合物在多器官、組織中沉積為特征，好發(fā)于育齡期女性［1］。由于SLE女性患者常發(fā)生妊娠相關并發(fā)癥及不良妊娠結(jié)局如流產(chǎn)、死胎、早產(chǎn)、子癇前期、胎兒宮內(nèi)生長受限（intra-uterine growth restriction，IUGR）等［2-3］，因此SLE一度被視為妊娠的禁忌。B細胞在SLE發(fā)病機制中具有重要作用，其免疫功能出現(xiàn)紊亂是導致SLE發(fā)生、發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)。近年來，調(diào)節(jié)性B淋巴細胞（regulatory B cells，Bregs）的免疫調(diào)節(jié)功能逐漸為人們所認識，其通過分泌IL-10、IL-35和轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β等細胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。在SLE和類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）等多種自身免疫性疾病中，Bregs存在數(shù)量及功能改變。在正常妊娠過程中，各種免疫細胞和細胞因子共同維持母體對胎兒的免疫耐受是良好妊娠結(jié)局的關鍵，一旦免疫環(huán)境調(diào)控失衡，不良妊娠結(jié)局隨之產(chǎn)生。本文就Bregs與妊娠合并SLE的關系進行綜述，以期為將來進一步探索Bregs在SLE免疫環(huán)境中以及妊娠免疫耐受中所起到的作用提供新方向，并為治療SLE以及預防和治療妊娠期狼瘡帶來新思路。

1 Bregs的表型與功能

傳統(tǒng)上認為，B細胞主要通過產(chǎn)生抗體、抗原遞呈、以及多種細胞因子發(fā)揮正向免疫調(diào)節(jié)作用。在2000年，MIZOGUCHI等［4］首次正式描述了一種B細胞亞群，這群細胞在炎癥性腸病模型小鼠中具有抑制炎癥的作用，即Bregs。此外，Bregs在實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）、膠原誘導性關節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）及結(jié)腸炎等實驗模型中也產(chǎn)生明顯抑制炎癥反應［5-7］。CORREALE等［8］觀察到多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）患者感染蠕蟲后產(chǎn)生IL-10分泌功能上調(diào)的B細胞亞群，首次證實Bregs在人體中的存在。目前對Bregs尚無統(tǒng)一的分類標準，多數(shù)研究根據(jù)Bregs分泌的細胞因子和表面標志對其進行分類。產(chǎn)生IL-10是識別Bregs的主要標志，人體內(nèi)產(chǎn)生IL-10的調(diào)節(jié)性B細胞主要為過渡性（未成熟）調(diào)節(jié)性B細胞（CD19+CD24highCD38high）和記憶性調(diào)節(jié)性B細胞（CD19+CD24highCD27+）。除了產(chǎn)生IL-10介導抑炎效應之外，Bregs還可分泌TGF-β和吲哚胺2，3-二氧化酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO），參與調(diào)節(jié)T細胞活化［9］；CD38+CD1 d+IgM+CD147+Bregs可分泌顆粒酶B（Granzyme B）誘導T細胞凋亡［10］；CD5+CD1dhiFcgRIIbhiBregs通過產(chǎn)生IL-35抑制CD4+CD25-T細胞表達IFN-γ，并提高CD4+CD25-Tregs比例。另外，目前與Bregs分化相關的關鍵轉(zhuǎn)錄因子仍在探索中，此前有研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Foxd3可直接結(jié)合并抑制IL-10啟動子，從而抑制B細胞向IL-10+Bregs分化［11］。但大多數(shù)研究認為Bregs細胞亞群的分化并非由于Bregs譜系特異性因子的表達，而可能是由于免疫微環(huán)境中不同的刺激因素所致，在不同環(huán)境作用下，未成熟B細胞、成熟B細胞以及漿母細胞都具有分化為IL-10+Bregs的潛能［12］。研究表明，炎癥微環(huán)境是Bregs激活/分化的先決條件，一些促炎癥細胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-21和GM-CSF，以及抑炎癥細胞因子如IL-35對Bregs的分化有重要作用，除此之外，Bregs的分化還需要Toll樣受體（TLRs）、CD40、B細胞受體（BCR）、CD80、CD86等細胞受體的介導［12-13］。

Bregs與其他免疫細胞之間的相互作用是目前免疫調(diào)控的研究熱點之一。研究發(fā)現(xiàn)Bregs可通過抑制輔助性T細胞（T helper cells，Th cells）和樹突狀 細 胞（dendritic cells，DCs）的 功 能，以 及 誘 導Tregs，從而抑制炎癥反應。在膠原誘導性關節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠模型中，Bregs可抑制Th1和Th17效應應答，并誘導產(chǎn)生分泌IL-10的調(diào)節(jié)性T細胞（Tr1）和FoxP3+Tregs，有效延緩疾病進展［6］。在WAS基因敲除（WAS-KO）小鼠中誘導RA后，Tregs和Bregs數(shù)量顯著減少，伴有Th17細胞數(shù)量上升，而將野生型小鼠的Bregs轉(zhuǎn)入WAS-KO小鼠可恢復其Tregs和Th17細胞數(shù)量的正常平衡［14］。IL-35可誘導產(chǎn)生分泌IL-10和IL-35的Bregs，將IL-35誘導產(chǎn)生的IL-10+Bregs注射入實驗性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis，EAU）小鼠模型體內(nèi)，相比于注射IL-10-B細胞的EAU小鼠，注射IL-10+Bregs的EAU小鼠體內(nèi)Tregs細胞比例隨之上調(diào)，而Th1和Th17細胞比例下降，并可觀察到炎癥明顯緩解［15］。除了IL-10之外，Bregs也可通過其他細胞因子發(fā)揮功能。Bregs可同時通過TGF-β/IDO通路和IL-10調(diào)節(jié)T細胞亞群的分化：TGF-β/IDO對效應T細胞的增殖起到抑制作用，同時在CTLA-4介導下促進Tregs擴增；而IL-10則起到抑制Th1反應的作用［9］。此外，Bregs表達的糖皮質(zhì)激素誘導的腫瘤壞死因子受體（glucocorticoid-induced TNF-related protein，GITR）對于誘導并維持Treg細胞數(shù)量具有重要意義，而這一作用不依賴于IL-10［16］。

Bregs還可通過與DCs相互作用發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。例如，CD11bhighMHC-ⅡlowDCs通過CD40LCD40通路以及DCs分泌的IFN-β促進脾臟B細胞分化為CD19highCD32bhighBregs，后者能分泌高水平IL-10，無論在體外還是體內(nèi)都能抑制CD4+T細胞增殖［17］。

2 Bregs與妊娠

正常妊娠并非是一個單純的免疫抑制狀態(tài)，而是復雜的局部和系統(tǒng)免疫調(diào)控過程。妊娠期多種激素作用在免疫調(diào)節(jié)中至關重要，雌激素（E2）、孕激素和人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）是主要調(diào)控激素，可抑制破壞性的免疫反應，誘導免疫耐受通路［18］，如妊娠期hCG可介導外周自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）細胞毒作用下調(diào)，有助于維持母胎免疫耐受［19］。同樣，B細胞也受妊娠期母體激素調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，95%的CD24hiCD27hiB細胞表達hCG受體，孕婦外周血中的hCG可促進Bregs表達IL-10［20］。SUBRAMANIAN等［21］發(fā)現(xiàn)用E2治療EAE小鼠后，可增加IL-10表達以及B細胞上負性共刺激分子PD-L1和B7.2的表達。此外，孕激素可促進Th2型免疫應答，減少促炎細胞因子的釋放，增加IL-10表達［22］。以上研究結(jié)果表明，包括Bregs在內(nèi)的B淋巴細胞在母體雌、孕激素及人絨毛膜促性腺激素的精密調(diào)控下，對母胎免疫耐受的形成和母胎界面交叉對話有重要的影響。在整個妊娠過程中，母體B細胞逐漸減少，但同時伴有祖B細胞、前B細胞、未成熟B細胞比例下降，成熟B細胞比例上調(diào)［23］，在妊娠早期，CD19+CD24hiCD27+Bregs比例上升，提示Bregs在早期母胎免疫耐受的形成中可能具有重要作用［20］；在妊娠晚期和分娩時，外周血中初始B細胞（na?ve B cell）比例增加，而過渡B細胞（transitional B cells）和CD24hiCD38hi-Bregs比例下降，這可能與妊娠晚期激素水平波動有關，也可能是過渡B細胞和Bregs遷移至母胎界面所致［24］，但目前該假說尚未得到證實。

Bregs作為IL-10的重要來源，與產(chǎn)科預后密切相關。IL-10是與妊娠結(jié)局相關的抗炎細胞因子。缺乏IL-10可導致自發(fā)性流產(chǎn)、宮內(nèi)生長受限，甚至死胎［25］。在妊娠子宮和胎盤都可檢測到大量IL-10，即使是在早期妊娠階段因父系抗原引起的炎癥反應也可由于IL-10的存在而被削弱，因此IL-10被視為對抗促炎反應的關鍵細胞因子［26］。在妊娠狀態(tài)下，耐受性樹突狀細胞與Tregs在IL-10和TGF-β的作用下形成免疫耐受微環(huán)境，一旦這些抗炎細胞因子如IL-10或TGF-β發(fā)生缺失，將影響誘導產(chǎn)生耐受性DCs和Tregs［27-28］。鑒于Bregs是IL-10和TGF-β的重要產(chǎn)生來源，其與Tregs及DCs的作用緊密聯(lián)系。JENSEN等［29］研究發(fā)現(xiàn)，將分泌IL-10的B10細胞轉(zhuǎn)移至自發(fā)性流產(chǎn)小鼠模型中，小鼠脾臟DCs保持未成熟狀態(tài)，并誘導Tregs亞群比例顯著上升，使小鼠母胎免疫耐受提高，從而改善自發(fā)性流產(chǎn)小鼠的妊娠結(jié)局。臨床研究表明，Bregs數(shù)量及功能異常與復發(fā)性流產(chǎn)、反復著床失?。╮epeated implantation failure，RIF）等不良妊娠結(jié)局具有顯著相關性［30］。在人類中，發(fā)生自發(fā)性流產(chǎn)的女性外周血中的CD19+CD24hiCD27+Bregs比例明顯低于正常妊娠女性和未孕女性［20］。另外，研究發(fā)現(xiàn)妊娠期使用利妥昔（rituximab）單抗（一種抗CD20單克隆抗體，可清除B淋巴細胞）可致孕早期自然流產(chǎn)率提高［31］，這可能與早期清除CD20+Bregs有關，提示Bregs的負向免疫調(diào)控作用是提高早期妊娠成功率的不可或缺的因素，明確Bregs在妊娠中的免疫調(diào)節(jié)機制是十分必要的。

3 Bregs與SLE

目前圍繞人類SLE的研究主要集中在免疫細胞以及抗體產(chǎn)生相關機制。自身抗體的產(chǎn)生是SLE的特征及診斷標準之一，其與自身抗原組成免疫復合物，可通過與Fc受體及補體結(jié)合，激活免疫系統(tǒng)，最終導致自身組織器官的損害。雖然自身抗體常見于SLE患者，但正常人群中也可出現(xiàn)高滴度的自身抗體卻無SLE或其他自身免疫性疾病的臨床表現(xiàn)，說明SLE的發(fā)生發(fā)展涉及多方面免疫紊亂，除了影響抗體生成外，還同時影響其他免疫效應過程［32］。

研究者通過對NZB/W F1狼瘡模型小鼠的研究發(fā)現(xiàn)在不同時間用CD20單克隆抗體清除B細胞對病情的影響截然不同：在NZB/W F1小鼠12～28周用CD20單抗清除B細胞可延緩狼瘡進展，延長小鼠生存期；而在NZB/W F1小鼠4周時用CD20單抗則加快疾病發(fā)生，降低生存率，這一差異與調(diào)節(jié)性B10細胞在早期即被CD20單抗清除有關［33］。進一步研究表明，缺乏CD5+CD1dhiBregs的NZB/W F1狼瘡小鼠更早出現(xiàn)腎炎表現(xiàn)且生存期明顯縮短，而將CD5+CD1dhiBregs過繼轉(zhuǎn)移至狼瘡小鼠后可明顯延長小鼠生存時間［34］，這說明B細胞作為多效性細胞，其中的Bregs亞群所發(fā)揮的負向調(diào)節(jié)功能在SLE的疾病進展中的作用不容小覷。另外，在MRL/lpr狼瘡模型小鼠中也存在IL-10+Bregs比例降低，與炎癥狀態(tài)下B淋巴細胞刺激因子（B cell activating factor，BAFF）激活NF-κB和JNK信號通路從而介導B細胞向IL-10-B細胞分化有關，而阻斷BAFF與其受體之間的作用后，MRL/lpr小鼠中IL-10+Bregs比例明顯增加［35］。以上研究結(jié)果說明在狼瘡模型小鼠中，Bregs數(shù)量異常對疾病進展可能起到關鍵作用。

研究表明在SLE患者中存在Bregs功能上的異常。SLE患者外周血中的CD24hiCD38hiB細胞數(shù)量與健康人群相比并無明顯差異，但其中IL-10+Bregs比例顯著降低，并且從SLE患者外周血提取的Bregs與健康人群的Bregs相比，前者抑制T細胞增殖的能力明顯下降，說明SLE患者存在Bregs功能受損［36-37］。健康人外周血中的CD19+CD24hiCD38hiBregs在體外可通過IL-10以及CD80、CD86的介導抑制CD4+T細胞表達TNF-α和IFN-γ，但SLE患者的外周血中CD19+CD24hiCD38hiBregs無法抑制T細胞炎癥因子的表達，且對CD40（對Bregs分化和功能起關鍵作用的表面分子）刺激無明顯反應，而在其他風濕性疾病如干燥綜合征及骨關節(jié)炎則無Bregs功能受損的表現(xiàn)［38］。CD19+CD24hiCD38hiBregs出現(xiàn)功能受損后，無法抑制初始T細胞分化為Th1和Th17，也無法誘導CD4+CD25-T細胞分化為具有免疫調(diào)節(jié)功能的Foxp3+Tregs［39］。此外，SLE患 者 的誘導性Bregs（induced Bregs，iBregs）對于Th細胞增殖的抑制作用也顯著低于正常人的iBregs［40］。以上結(jié)果說明Bregs的抑炎功能受損是SLE發(fā)生發(fā)展的可能機制之一，其在SLE中具有一定的特異性，這也為SLE的靶向性治療提供了新的方向。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Bregs和漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）之間的反饋調(diào)節(jié)異常是SLE潛在的發(fā)病機制。pDCs通過IFN-α釋放和CD40-CD40L介導而誘導CD19+CD24hiCD38hiB細胞（未成熟B細胞）分化為表達IL-10的CD24+CD38hiBregs和漿母細胞，且高濃度IFN-α可使未成熟B細胞傾向于向漿母細胞分化，而IL-10可抑制pDC過度表達IFN-α［41］。但在SLE患者中，pDCs誘導分化CD24+CD38hiBregs的過程顯著受抑制，這一作用與STAT1和STAT3激活改變相關［42］，說明在SLE中，Bregs和pDCs之間的免疫反饋調(diào)節(jié)存在功能障礙是Bregs細胞數(shù)量和功能異常的可能原因。

綜上所述，Bregs可誘導并維持外周包括Foxp3+Tregs在內(nèi)的抑制性CD4+T細胞數(shù)量，同時下調(diào)Th1、Th17介導的促炎反應，從而保持Th1/Th2反應的平衡，并與pDCs之間相互作用，對SLE也存在潛在的調(diào)節(jié)作用（圖1）。

圖1 Bregs對不同免疫細胞的影響Fig.1 Schematic diagram of effects of Bregs on different immune cells

4 Breg與妊娠合并SLE

妊娠合并SLE構成一個特殊的免疫困境：首先，妊娠過程本身已構成對母體免疫系統(tǒng)的挑戰(zhàn)，這一過程需要免疫系統(tǒng)中不同的細胞亞群共同參與，進行雙向免疫調(diào)控，從而達到相對“免疫抑制”狀態(tài)；此外，SLE因其特征性的免疫調(diào)節(jié)失衡，造成自身抗體、多種促炎細胞因子過度表達；并且SLE病情活動度與激素水平相關，而妊娠期間的激素波動可能是觸發(fā)狼瘡活動的因素之一，對母體和胎兒帶來相當大的風險。

無論是在妊娠狀態(tài)下，還是在自身免疫性疾病、移植免疫耐受以及腫瘤微環(huán)境中，Bregs介導的免疫抑制作用是相似的［10］。Bregs通過誘導和維持Tregs數(shù)量、改變Th反應以及抑制效應細胞（包括細胞毒性T細胞、NK和DCs等）的作用而發(fā)揮免疫抑制效應（圖1）［43-44］。在妊娠狀態(tài)下，Bregs在母體激素的調(diào)控下與其他其他免疫細胞相互作用，維持母胎界面免疫微環(huán)境的穩(wěn)定，而SLE患者常存在Bregs數(shù)量及功能紊亂，打破母胎免疫耐受，可能是造成不良妊娠結(jié)局的原因之一。

在一項研究中，對難治性SLE患者在孕前予以利妥昔單抗治療，5例患者均在利妥昔單抗治療后8～22個月內(nèi)懷孕，其中有2例患者分別于孕31周和孕32周出現(xiàn)早產(chǎn)，并且1例患者從孕21周起尿蛋白逐漸升高，腎小球濾過率（eGFR）下降［45］，說明清除B細胞并不能完全有效控制孕期狼瘡活動及改善妊娠結(jié)局，這也為靶向清除致病性B細胞而保留具有免疫調(diào)節(jié)作用的Bregs提供了支持。

此前研究表明，Tregs在SLE患者妊娠期發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用［46］。在SLE患者中，Tregs細胞數(shù)量和功能均存在損害，而Tregs可抑制Th1、Th17分泌促炎細胞因子，在維持母體免疫耐受方面發(fā)揮重要作用［47］。根據(jù)目前研究表明，Bregs對T細胞的調(diào)節(jié)具有雙重作用：其一，Bregs通過抑制CD4+T細胞分化為Th1和Th17從而減少過量促炎因子的釋放；其二，Bregs可誘導效應T細胞轉(zhuǎn)化為Tregs而發(fā)揮T細胞對免疫應答的負向調(diào)節(jié)作用［39］。雖然目前Bregs在妊娠合并SLE中的存在狀態(tài)及作用機制仍需進一步研究，但隨著Bregs細胞在免疫調(diào)節(jié)中所起的作用逐漸為人所知，其對Tregs及其他免疫細胞的調(diào)控作用可為孕期狼瘡活動的相關機制提供新的研究思路，也提示了以Bregs作為靶點的治療策略具有潛在的應用價值。

5 小結(jié)與展望

Bregs的負向調(diào)節(jié)免疫應答功能在妊娠狀態(tài)下及多種自身免疫性疾病如RA、SLE中的作用不容忽視，但目前對于Bregs的研究仍面臨較多問題，Bregs的表型及分化發(fā)育過程目前仍不甚明了，其作用機制有待進一步思考與探究。在婦產(chǎn)科及風濕科等多學科的共同努力下，SLE妊娠已不再是禁忌，但其特征性的免疫失衡為母體和胎兒都帶來巨大的風險，因此妊娠合并SLE仍應被視為高危妊娠。SLE患者中存在Bregs數(shù)量及功能異常，使得Bregs難以正常發(fā)揮負向免疫調(diào)節(jié)功能，進一步促進免疫失衡，對胎兒所需的母體免疫耐受環(huán)境構成挑戰(zhàn)。因此，隨著對Bregs與妊娠合并SLE的關系進行深入探究，不同Bregs亞群所特有的細胞標記、其分泌的細胞因子及與其他免疫細胞的作用通路可成為SLE治療的突破點，并可為妊娠期狼瘡活動機制提供一個新的研究方向，這將有助于開拓對SLE相關不良妊娠結(jié)局的預防及干預策略。