張錦銳，吳 昊，白 易，張雅敏

1 天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津 300070；2 衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點實驗室，天津 300192；3 天津市第一中心醫(yī)院 肝膽外科，天津 300192

缺血性膽管損傷(ischemic-type biliary lesions, ITBL)是肝移植術(shù)后嚴重并發(fā)癥之一，往往需要反復(fù)進行侵入性膽道手術(shù)，最終可能導(dǎo)致患者再次移植甚至死亡[1]。ITBL的主要發(fā)病原因為器官的缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury, IRI)，表現(xiàn)為供肝非吻合口部位變薄、狹窄、擴張等，影響患者肝功能，由于其發(fā)病率較高且患者預(yù)后較差，因此探究降低ITBL發(fā)生率的新方法，提高肝移植手術(shù)成功率具有重要臨床意義[2-3]。曲美他嗪(Trimetazidine, TMZ)是一種調(diào)節(jié)代謝抗氧化抗缺血的藥物，在臨床上被廣泛用于治療缺血性心臟病，可通過提高細胞缺氧狀態(tài)下的能量利用和抗氧化應(yīng)激、抗凋亡能力等途徑增強細胞的缺血缺氧耐受力[4]。已有相關(guān)研究[5]表明，TMZ可減輕大鼠肝臟IRI，但其對膽管IRI的作用尚不明確。本研究擬通過構(gòu)建大鼠ITBL模型，探明TMZ對ITBL的保護作用及其潛在機制，為減輕ITBL豐富思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SPF級SD大鼠，體質(zhì)量在200～250 g之間，購自北京維通利華有限公司，飼養(yǎng)在晝夜輪替各12 h的環(huán)境中，自由飲食，適應(yīng)環(huán)境1周后開始實驗。實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(京)2016-0006；實驗動物使用許可證編號：SYXK(津)2019-0004。

1.2 主要試劑 TMZ(法國施維雅公司)，水合氯醛(美國Sigma公司)，超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、脂質(zhì)氧化檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天公司)，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(武漢博士德生物公司)，兔抗人核因子紅系2相關(guān)因子2(Nrf2)、血紅素加氧酶-1(HO-1)、抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、半胱天冬酶-3(Caspase-3)、β-肌動蛋白(β-actin)以及山羊抗兔IgG(英國Abcam公司)。

1.3 方法

1.3.1 分組 采用隨機數(shù)字表法將40只大鼠隨機分為4組：(1)假手術(shù)組(Sham組，n=10)；(2)膽管缺血模型組(BIRI組，n=10)；(3)術(shù)前6 h TMZ預(yù)處理組(TMZ-6h組，n=10)，術(shù)前6 h TMZ灌胃(10 mg/kg)；(4)術(shù)前3 d TMZ預(yù)處理組(TMZ-3d組，n=10)，術(shù)前3 d每天TMZ灌胃(10 mg·kg-1·d-1)。Sham組、BIRI組、TMZ-6h組術(shù)前3 d每天給予和TMZ-3d組相同液體量的生理鹽水灌胃。

1.3.2 大鼠ITBL模型構(gòu)建和取材 術(shù)前12 h禁食，4 h禁水。5%水合氯醛(0.6 mL/100 g)腹腔注射麻醉，常規(guī)備皮，消毒鋪巾，取腹部正中切口進入腹腔；充分暴露肝臟及其周圍組織，離斷肝臟周圍韌帶，再向上翻動肝臟，顯露膽總管、門靜脈及肝固有動脈，同時離斷胃及十二指腸周圍韌帶。使用無損傷血管夾在近肝門處夾閉肝固有動脈和膽總管遠端，30 min后松開血管夾恢復(fù)血供并關(guān)腹。Sham組僅充分暴露肝臟并翻動肝臟后關(guān)腹。各組大鼠術(shù)后24 h再次麻醉后開腹，使用5 mL注射器從下腔靜脈采血2～3 mL，4 ℃ 3000 r/min離心10 min，收集血清-80 ℃保存。每組各取5只大鼠膽管組織浸泡于10%多聚甲醛中固定。每組剩余的5只大鼠膽管組織在冰面上用組織剪剪碎后放入-80 ℃冰箱保存。

1.3.3 膽管組織病理學(xué)檢查 取出固定48 h后的膽管組織，修剪后沖洗、脫水，再放入二甲苯中進行透明處理，然后石蠟包埋，切片，60 ℃烤箱烘烤2 h，置于載玻片后放入45 ℃恒溫箱中烘干；二甲苯脫蠟、組織軟化，蘇木精、伊紅染色，顯微鏡下觀察膽管形態(tài)。

1.3.4 血清生化檢測 取已收集的血清采用全自動生化分析儀檢測 ALT、ALP、DBil等指標。

1.3.5 SOD活性、丙二醛(MDA)水平檢測 每組取出5只大鼠膽管組織分別稱重，加入RIPA進行勻漿；將勻漿液4 ℃ 12 000×g離心5 min收集上清作為待測樣品，用BCA法檢測各組裂解液中蛋白濃度。依據(jù)說明書步驟完成每步操作，并使用酶標儀測量相應(yīng)波長的吸光度。再根據(jù)各組蛋白濃度計算出每毫克蛋白的SOD活力單位和MDA水平。

1.3.6 Western Blot檢測蛋白表達 將第5步所得剩余樣本，98 ℃金屬浴10 min使蛋白充分變性。依次進行電泳、轉(zhuǎn)模、封閉、一抗孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，二抗孵育，TBST再次洗滌3次，曝光。

2 結(jié)果

2.1 膽管病理變化 術(shù)后24 h(再灌注24 h)，Sham組大鼠膽管組織上皮細胞連續(xù)性完整，結(jié)構(gòu)正常；BIRI組可觀察到大鼠不連續(xù)的膽管上皮，伴壞死脫落，少量炎細胞浸潤；TMZ-6h組與BIRI組相比，無明顯改善；TMZ-3d組大鼠膽管上皮邊緣較清晰，少量壞死脫落細胞，與BIRI組相比顯著好轉(zhuǎn)(圖1)。

注：a，Sham組；b，BIRI組；c，TMZ-6h組；d，TMZ-3d組。

2.2 血清ALT、ALP、DBil變化 與Sham組相比，BIRI組ALT、ALP、DBil水平均明顯升高(P值均<0.05)；TMZ-6h組與BIRI組相比，ALT、ALP、DBil水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)；TMZ-3d組與BIRI組相比，ALT、ALP、DBil水平均顯著降低(P值均<0.05)(表1)。

2.3 膽管組織SOD、MDA變化 與Sham組相比，BIRI組膽管組織中的SOD活性顯著降低(P<0.05)，TMZ-6h組與BIRI組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，TMZ-3d組則顯著高于BIRI組(P<0.05)(表1)。與Sham組比較，BIRI組膽管組織中MDA水平明顯升高(P<0.05)，TMZ-6h組相較于BIRI組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，TMZ-3d組與BIRI組相比顯著降低(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠血生化指標和膽管組織氧化應(yīng)激指標比較結(jié)果

2.4 氧化應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白表達變化 與Sham組相比，BIRI組Nrf2、HO-1及活化的Caspase-3蛋白表達水平均顯著升高，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P值均<0.05)；TMZ-6h組Nrf2、HO-1、Bcl-2及活化的Caspase-3蛋白表達水平與BIRI組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)；TMZ-3d組Nrf2、HO-1和Bcl-2蛋白表達水平較BIRI組明顯增高，而活化的Caspase-3表達水平明顯降低(P值均<0.05)(圖2)。

圖2 各組大鼠膽管組織氧化應(yīng)激與凋亡相關(guān)蛋白表達水平

3 討論

目前常用的大鼠膽管IRI模型有：Kamada等[6]的“雙袖套法”原位肝移植模型，Zhao等[7]建立的大鼠自體肝移植模型，以及夾閉再通肝左、右動脈和膽管的IRI模型[8]。原位肝移植模型雖最真實地還原了臨床肝移植手術(shù)過程，但存在操作難度大、術(shù)后異體免疫排斥反應(yīng)等缺點。自體肝移植模型雖無異體免疫排斥反應(yīng)，但因上肝和下肝等所有操作均在同一只大鼠身上完成，存在手術(shù)時間過長等問題。夾閉再通肝動脈和膽管這一方法操作簡便，且較好地模擬了膽管組織缺血和再灌注的全過程，是研究膽管IRI的較理想方法。因此筆者團隊選擇該方法作為研究膽管IRI的模型。

TMZ作為良好的抗心絞痛藥物，其作用機制是通過促進細胞在缺氧狀態(tài)下ATP的形成和減輕酸中毒來改善缺血心肌的代謝[9]。2021年一項關(guān)于豬腎移植的研究[10]表明，TMZ可通過減輕氧化應(yīng)激、炎癥細胞因子的釋放，維持線粒體功能、細胞能量平衡，發(fā)揮腎臟保護作用。另一項關(guān)于大鼠肝移植的研究[11]揭示了TMZ可通過激活A(yù)MPK途徑抑制細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕肝移植供肝的IRI。這些研究均提示TMZ對細胞IRI具有一定的保護作用。為探究TMZ對肝移植術(shù)后缺血膽管組織是否具有保護作用，筆者利用大鼠膽管缺血性損傷模型加以驗證。首先TMZ預(yù)處理6 h后，膽管IRI并未明顯改善；隨后參考文獻[12]方法將TMZ預(yù)處理時間延長至3 d，膽管IRI發(fā)生了較顯著改善。這表明TMZ對大鼠膽管 IRI的保護作用并不能立即生效，而需要一定的作用時間，原因可能是由于TMZ發(fā)揮作用具有一定的時間依賴性。另外，本研究只觀察了再灌注24 h的膽管組織，而TMZ對再灌注更長期的膽管組織變化的影響仍需進一步明確。血清ALT、ALP、DBil等是臨床上常用的膽道疾病檢測指標，具有較好的特異性。通過對這些指標的檢測，說明了TMZ對膽管IRI的保護作用。

當器官發(fā)生IRI時，細胞產(chǎn)生大量活性氧自由基(ROS)，誘導(dǎo)細胞大分子氧化修飾，抑制蛋白質(zhì)功能，損傷線粒體DNA等，促進細胞凋亡，導(dǎo)致器官損傷[13]。SOD是組織細胞內(nèi)的一種重要抗氧化酶；MDA是生物體內(nèi)ROS作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)生成的產(chǎn)物，MDA的集聚能加劇細胞膜的損傷。因此檢測組織內(nèi)SOD和MDA水平可間接反映機體氧化應(yīng)激程度。本研究通過檢測大鼠膽管IRI后，膽管組織內(nèi)的SOD、MDA水平，證明了氧化應(yīng)激反應(yīng)參與膽管IRI過程，同時TMZ減輕了膽管IRI過程中的氧化應(yīng)激現(xiàn)象。值得注意的是，在TMZ預(yù)處理6 h后，大鼠膽管組織SOD和MDA水平與BIRI組相比無明顯變化，這與本研究膽管組織病理結(jié)果相吻合。

Nrf2是組織細胞內(nèi)廣譜的調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵因子，參與了多條抗氧化應(yīng)激、抗凋亡通路[14]；HO-1是Nrf2下游直接發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用的關(guān)鍵酶之一，能夠抑制組織細胞發(fā)生的氧化應(yīng)激、凋亡等過程。有研究[15]發(fā)現(xiàn)，通過給予小鼠促進Nrf2釋放的藥物，增加HO-1的表達，減輕了小鼠肝臟IRI。為進一步明確TMZ減輕膽管IRI的機制，本研究將Nrf2和HO-1作為氧化應(yīng)激通路的標志物，通過Western Blot檢測了各組大鼠膽管組織中兩種蛋白的表達情況，同時檢測了凋亡經(jīng)典信號分子Bcl-2和Caspase-3蛋白表達情況，以明確組織凋亡情況，研究結(jié)果表明TMZ可能通過Nrf2/HO-1通路，降低大鼠膽管細胞凋亡，減輕膽管IRI。

綜上，本研究證明了TMZ預(yù)處理可改善膽管IRI。其機制可能為TMZ激活Nrf2，促進HO-1的表達，抑制了膽管細胞的氧化應(yīng)激和凋亡。這為未來臨床治療肝移植后ITBL提供了新的思路。關(guān)于TMZ的有效給藥方案，筆者團隊會進一步加以探究。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2016年3月4日經(jīng)由天津市第一中心醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批，批號：2016-03-A1，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻聲明：張錦銳負責課題設(shè)計，實施實驗，數(shù)據(jù)分析及撰寫論文；吳昊參與實驗，修改論文；白易負責實驗指導(dǎo)，修改論文；張雅敏負責指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。