毛元鵬，魏紅山,2

1 北京大學(xué)地壇醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院 消化科，北京 100015；2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院 消化科，北京 100015

細胞極性是多數(shù)細胞維持正常生理生化功能的必需屬性。無論是上皮細胞，還是不對稱分裂細胞，均高度依賴細胞極性以維持其正常功能[1]。1926年，Bunting等[2]發(fā)現(xiàn)機械張力決定著正在發(fā)育的分裂期成纖維細胞的極性和空間位置。從最簡單的無脊椎動物，到脊椎動物上皮細胞的結(jié)構(gòu)分布，均存在不同形態(tài)的細胞極性。許多極性決定因子具有腫瘤抑制或促癌作用，并且在各種不同的腫瘤細胞中表達異常[3]。肝細胞具有特殊的細胞極性，并且其極性的穩(wěn)定性與多種肝病相關(guān)，其中的極性調(diào)控分子機制仍有待闡明。

1 對肝細胞極性的認識過程

肝實質(zhì)細胞是肝臟的主要功能細胞，是高度特化的極性上皮細胞。1975年，Evans等[4]報道了對大鼠肝細胞表面膜功能極性的研究，這是較早有關(guān)肝細胞極性的相關(guān)研究。隨后，研究人員在新鮮分離的大鼠肝細胞中發(fā)現(xiàn)，細胞極性喪失的同時，細胞間連接結(jié)構(gòu)也無法檢測到，提示細胞間連接與肝細胞極性之間有著重要聯(lián)系。1993年，研究人員進一步發(fā)現(xiàn)Disse間隙中的細胞外基質(zhì)(ECM)控制著肝細胞極性的發(fā)展。得益于過去數(shù)十年的深入研究，目前對肝細胞極性的認識已有了重大進展，眾多相關(guān)蛋白分子及結(jié)構(gòu)成分被逐漸揭示。然而，更為全面的肝細胞極性調(diào)控分子機制研究仍然有待進一步完善。

2 影響肝細胞極性的結(jié)構(gòu)特征

肝細胞極性分為結(jié)構(gòu)極性和功能極性。每個肝細胞表面可分為竇狀隙面、肝細胞面和膽小管面，肝細胞極性機制便體現(xiàn)在細胞形態(tài)和功能上。肝細胞通過竇狀隙面與血液循環(huán)進行物質(zhì)交換，從膽小管面分泌膽汁，而肝細胞面則參與細胞間接觸。為了介導(dǎo)這些功能，肝細胞形成不同的極化腔域，并通過緊密連接(tight junction，TJ)隔開[5]。一旦肝細胞極性受到破壞，肝細胞的物質(zhì)交換、膽汁分泌等重要生理功能將會發(fā)生障礙，導(dǎo)致多種肝臟疾病的發(fā)生。ECM的穩(wěn)定性以及細胞間連接是決定肝細胞極性的關(guān)鍵，多蛋白及其復(fù)合體參與了肝細胞極性的維持。

2.1 細胞間連接 上皮細胞主要有3種細胞間連接方式：TJ、黏附連接(adherens junction，AJ)和橋粒。在單細胞培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)，單細胞呈現(xiàn)出無極性狀態(tài)，提示細胞極性的建立和維持依賴細胞間連接的存在。

TJ是位于細胞-細胞接觸最頂端區(qū)域的上皮細胞間連接，由跨膜蛋白和將連接復(fù)合物與細胞骨架連接的胞質(zhì)蛋白組成，包括密封蛋白-1(claudin-1，CLDN1)，連接黏附分子，閉鎖連接蛋白1、2、3等。TJ的組裝通過調(diào)節(jié)膜蛋白的極化定位，維持細胞極性的穩(wěn)定，并產(chǎn)生電化學(xué)濃度梯度，從而維持上皮細胞的物質(zhì)運輸功能[6]。此外，TJ還充當極性信號蛋白的支架，包括Par3/Par6/非典型蛋白激酶C(atypical protein kinase C，aPKC)復(fù)合物和Crumbs/PALS1/PATJ復(fù)合物，從而在細胞極性中發(fā)揮作用。最近研究[7]發(fā)現(xiàn)，TJ蛋白Par3通過與小GTPase Cdc42合作將aPKC靶向至細胞-細胞接觸中心附近以組織肝細胞極化。

AJ由上皮細胞鈣黏蛋白、α-catenin和β-catenin等組成，對上皮細胞極性的產(chǎn)生和維持起著重要作用。鈣黏蛋白是AJ的關(guān)鍵成分，其下調(diào)可引起AJ的破壞，進而導(dǎo)致細胞極性喪失，在多種腫瘤中發(fā)揮促進腫瘤侵襲的作用[8]。

細胞間連接將上皮細胞連接在一起形成結(jié)構(gòu)和功能的連續(xù)體，連接的完整性決定了上皮細胞正常功能的行使，而連接的缺陷將導(dǎo)致組織的廣泛異常，破壞體內(nèi)平衡，繼而引發(fā)各類疾病。

2.2 細胞外基質(zhì)(ECM) ECM是一種復(fù)雜的大分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，負責維持組織的結(jié)構(gòu)完整性并調(diào)節(jié)細胞和組織功能[9]。肝細胞中極性和功能的成熟依賴于細胞-ECM之間的相互作用。在體外實驗中，肝細胞在塑料上培養(yǎng)不表現(xiàn)出極性，而在ECM培養(yǎng)中有極性表達。而且，ECM-細胞-ECM形成的“三明治”結(jié)構(gòu)對細胞極性的產(chǎn)生和維持起著關(guān)鍵作用。顯然，作為ECM骨架結(jié)構(gòu)的膠原蛋白空間是構(gòu)成ECM的核心。前期筆者團隊[10-11]對肝星狀細胞的功能調(diào)控研究即發(fā)現(xiàn)，抑制O-糖基化修飾可加重肝損傷，并對膠原蛋白表達具有直接的抑制作用。近期，筆者團隊[12-14]研究發(fā)現(xiàn)，抑制膠原蛋白的Glcα1和2Galβ1-糖基化修飾可導(dǎo)致肝細胞損傷及膠原分泌障礙及脂質(zhì)代謝異常；進一步觀察發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎致死(E11.5)，伴有肝臟等中胚層發(fā)育異常。體外膠原蛋白夾層培養(yǎng)實驗[15]表明，ECM蛋白與某些生長因子在特定區(qū)域的定位是肝細胞極性表型發(fā)育所必需。

2.3 極性蛋白復(fù)合體 上皮細胞頂-底極性復(fù)合體主要包括Scribble復(fù)合體、Crumbs復(fù)合體以及Par復(fù)合體，這些極性蛋白復(fù)合體在細胞極性的建立和調(diào)控上發(fā)揮著重要作用。

Scribble復(fù)合體位于上皮細胞基底膜，由Scrib、Lgl和Dlg 3種蛋白組成，與細胞極性的建立有關(guān)。正常肝臟組織中，Scrib蛋白主要表達于細胞膜上；而在肝臟腫瘤中，Scrib蛋白呈高表達狀態(tài)，并主要表達于細胞質(zhì)和細胞核[16]。研究[17]顯示，肝細胞癌(HCC)患者肝臟Scrib蛋白過表達與患者的不良預(yù)后相關(guān)，Scrib蛋白過表達并富集于胞質(zhì)，引起細胞極性異常，促進了HCC發(fā)展和轉(zhuǎn)移。

Crumbs復(fù)合體位于頂端結(jié)構(gòu)域，包括跨膜蛋白Crumbs和胞內(nèi)信號接頭蛋白PALS1、PATJ。Crumbs復(fù)合物與上皮極性和細胞連接形成相關(guān)，在HIPPO通路中是重要的上游調(diào)節(jié)劑。Crumbs蛋白對細胞極性的影響與一些氨基酸位點有關(guān)，第7位精氨酸對Crumbs招募膜突蛋白和β-spectrin有作用從而影響AJ形成[18]，第6位和第9位氨基酸影響頂部決定因子之間的正反饋以及頂-基底之間決定因子的相互拮抗[19]，從而影響細胞頂-底極性的建立。

Par復(fù)合物，包括Par3-Par6-aPKC復(fù)合物，在進化上十分保守，與TJ的建立有關(guān)。Par蛋白家族包括Par1～6，各自具有不同結(jié)構(gòu)域及功能。Par3作為Par3/Par6/aPKC復(fù)合體的中心組織者，對細胞極性的建立和維持至關(guān)重要。Par3的缺失將導(dǎo)致PAR復(fù)合物的分離和上皮極性的喪失。轉(zhuǎn)錄因子SNAIL家族蛋白——SNAI1 是促進上皮特征(包括極性和連接)喪失的關(guān)鍵因素。SNAI1蛋白不穩(wěn)定，aPKC介導(dǎo)的SNAI1磷酸化促進SNAI1蛋白降解，使內(nèi)源性SNAI1蛋白失穩(wěn)，從而維持上皮特征，防止上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)發(fā)生[20]。因此，Par復(fù)合物缺失介導(dǎo)的極性破壞可能通過SNAI1促進體內(nèi)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[21]。

目前，已經(jīng)在多種人類癌癥中發(fā)現(xiàn)極性蛋白復(fù)合物的異常，提示極性蛋白的改變不僅破壞細胞極性，并對癌癥的發(fā)生發(fā)展可能有直接的影響。

3 研究肝細胞極性的細胞學(xué)模型

隨著各種生物技術(shù)的發(fā)展，肝細胞的培養(yǎng)技術(shù)日漸成熟。然而，傳統(tǒng)的3D培養(yǎng)無法有效保持肝細胞極性。Jia等[22]采用微流控芯片三維培養(yǎng)技術(shù)與天然海藻酸鹽水凝膠相結(jié)合，通過借鑒肝細胞在肝臟的極性肝板排列，及其與非實質(zhì)細胞、ECM相互作用的仿生學(xué)原理，構(gòu)建模仿肝板的3D肝組織，從而有效保持肝細胞極性。在該培養(yǎng)技術(shù)中，肝細胞的功能、極性蛋白的表達均隨著培養(yǎng)時間的增加而得到增強，表明該技術(shù)可以提供更好的體外3D培養(yǎng)平臺，可用于藥物開發(fā)、肝細胞極性研究等。

在既往研究中，關(guān)于肝細胞極性的組成和機制均在極化細胞(HepG2、WIF-B、和犬腎細胞等)中確定。近些年來，不斷有新的極性功能實驗在多能干細胞中進行，并且取得了重大進展。多能干細胞是一類具有自我更新、自我復(fù)制能力的多潛能細胞，具有分化為多種細胞組織的潛能。誘導(dǎo)多能干細胞衍生的肝細胞樣細胞(hepatocyte-like cell，HLC)可以提供一個新的選擇來滿足極化肝細胞培養(yǎng)模型的需求。HLC通常在2D培養(yǎng)條件下在培養(yǎng)皿中分化，這一過程效率低下且產(chǎn)生的HLC不成熟，缺乏關(guān)鍵的體內(nèi)特征，包括細胞極性。最近有研究[23]報道一種基于干細胞分化，使用TransWell濾過器生成柱狀極化HLC的方案，并證實極化HLC定向分泌物質(zhì)。這種新穎的干細胞分化方案提供了一個強大的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)來研究適當?shù)母渭毎δ?，這不僅有利于更好地了解正常的肝臟生理，而且還能進一步了解極性相關(guān)肝病的發(fā)病機制。值得注意的是，在HLC培養(yǎng)過程中，細胞間相互作用是誘導(dǎo)細胞極性和功能成熟的重要因素[24]。

4 肝細胞極性調(diào)控相關(guān)信號通路

肝細胞極性的調(diào)節(jié)不僅表現(xiàn)在各種結(jié)構(gòu)成分的組成上，同樣重要的還有發(fā)生在細胞內(nèi)外的復(fù)雜的分子信號通路。在整個尚未完全闡明的信號網(wǎng)絡(luò)中，介紹以下幾種主要通路。

4.1 AMP依賴的蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)相關(guān)信號通路 TJ是維持細胞極性的關(guān)鍵因素之一，而AMPK在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用?，F(xiàn)有研究[25]表明，當AMP/ATP比值升高時，可以通過肝激酶B1磷酸化激活A(yù)MPK，促進上皮細胞之間的TJ形成。此外，AMPK還可以影響膽汁分泌。膽汁酸具有信號分子的作用，可升高細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷水平。2000年，Ng等[26]首先報道了膽汁酸促進肝細胞極化的現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)膽汁酸能夠?qū)Υ笫蟾伟┘毎麡O性進行可逆性誘導(dǎo)。此外，F(xiàn)u等[27]使用大鼠原代肝細胞的膠原夾心培養(yǎng)物，評估牛磺膽酸對初級肝細胞夾心培養(yǎng)模型中極性發(fā)展的影響，確定了?；悄懰猁}可通過激活環(huán)磷酸腺苷-Eapc-Rap1-絲裂原活化細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶-肝激酶B1-AMPK 通路影響肝細胞極性，表明膽汁酸產(chǎn)生和肝細胞極性之間存在關(guān)聯(lián)。此外，AMPK還是一種調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)的細胞能量傳感器，可通過協(xié)調(diào)多種細胞器及細胞過程以維持肝細胞極化過程的能量需求[28]。

4.2 Wnt/β-catenin通路 經(jīng)典的 Wnt/β-catenin通路是一種十分保守的信號傳導(dǎo)機制，可調(diào)節(jié)許多關(guān)鍵的生理和病理過程(細胞增殖、分化和極性)。β-catenin通過與α-catenin結(jié)合將上皮鈣黏素(E-cadherin)與肌動蛋白細胞骨架連接，在AJ中發(fā)揮作用。在特異性敲除β-catenin的肝細胞中，可觀察到γ-catenin基因表達保持不變，但其絲氨酸/蘇氨酸磷酸化水平明顯增加，以補償AJ處β-catenin的缺失[29]。而肝細胞中β-catenin和γ-catenin的雙重丟失，可引起TGFβ通路的激活，進而下調(diào)肝細胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4alpha，HNF4α)的水平和活性，從而導(dǎo)致肝細胞極性的喪失[30]。

4.3 抑瘤素M(oncostatin M，OSM) OSM是IL-6家族的多效性細胞因子，可由多種類型細胞產(chǎn)生。OSM參與多種生物過程(造血、成骨、肝臟發(fā)育等)。在胚胎中，非極化的肝母細胞在OSM和TNFα的信號刺激下分化為極化的肝細胞[31]。OSM介導(dǎo)的K-ras信號通過改變包括 E-cadherin和β-catenin在內(nèi)的TJ相關(guān)蛋白亞細胞定位來誘導(dǎo)AJ形成。在轉(zhuǎn)染人重組OSM的HepG2細胞中，觀察到EMT過程相關(guān)變化，如細胞間接觸廣泛喪失以及E-cadherin表達下調(diào)[32]，提示OSM介導(dǎo)的信號通路與肝細胞極性的調(diào)節(jié)有關(guān)。

5 轉(zhuǎn)錄因子對肝細胞極性的影響

HNF4α作為一種轉(zhuǎn)錄因子，對哺乳動物肝臟發(fā)育過程中的肝細胞分化必不可少。HNF4α表達失調(diào)與多種肝病(肝硬化、HCC)有關(guān)[33]。缺乏HNF4α的肝細胞沒有進行正常的細胞接觸，細胞黏附和連接發(fā)生廣泛障礙，導(dǎo)致肝體積增大并伴有明顯的脂肪變性[34]，提示HNF4α能夠通過調(diào)節(jié)黏附及連接相關(guān)蛋白表達水平進而影響肝細胞極性的維持。此外，在HCC肝組織中，HNF4α表達顯著降低，HCC中細胞-細胞和細胞-ECM黏附減少，細胞極性喪失，端粒酶活性增加以及肝臟特異性基因表達受到抑制[35]。

6 微小RNA(microRNA，miRNA)對肝細胞極性的影響

miRNA是一種非編碼小RNA，通過與mRNA結(jié)合而干擾翻譯過程。miRNA能夠影響AJ和TJ蛋白的表達以及細胞骨架重塑。但是，關(guān)于miRNA在肝細胞極性的建立和維持中的具體作用及相關(guān)機制尚不清楚。在HCC患者癌組織中，多種miRNA表達水平發(fā)生改變。研究[36]發(fā)現(xiàn)，miRNA-144可通過與?；撬嵘险{(diào)基因1相互作用激活JAK2/STAT3通路，促進HCC細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，而牛磺酸上調(diào)基因1敲低通過使JAK2/STAT3通路失活上調(diào)miRNA-144來抑制HCC腫瘤生長。

7 肝細胞極性與肝臟疾病

7.1 病毒性肝炎 研究[37]發(fā)現(xiàn)，在HCV感染的HepG2細胞中，HCV與細胞兩側(cè)端均有結(jié)合，但感染主要發(fā)生在基底外側(cè)區(qū)域，且新合成的子代病毒優(yōu)先從基底外側(cè)區(qū)域釋放。另有研究[38]證實，TJ蛋白在HCV感染過程中發(fā)揮重要作用。HCV進入肝細胞與多種因子相關(guān)，包括B1型清道夫受體(scavenger receptor B1，SR-B1)、分化簇81、表皮生長因子受體、CLDN1和閉合蛋白。

CD81缺少膜信號序列，但可聚集在細胞膜微區(qū)中，并參與多種細胞功能，如細胞黏附、遷移和增殖等。但值得一提的是，與其他宿主因子(如低密度脂蛋白受體或SR-B1)的相互作用可能需要誘導(dǎo)HCV糖蛋白E2的構(gòu)象變化以暴露CD81結(jié)合位點。SR-B1作為脂蛋白受體，可直接與E2結(jié)合發(fā)揮作用。LDLR不與E2結(jié)合促進病毒攝入，而是與HCV脂質(zhì)病毒顆粒中的天然配體低密度脂蛋白結(jié)合促進病毒RNA的復(fù)制。CLDN1可以與HCV糖蛋白E1/E2異二聚體結(jié)合，同時可以與CD81結(jié)合形成復(fù)合體，促進病毒內(nèi)吞過程。HCV最初附著于表面蛋白多糖和脂質(zhì)受體上如SR-B1和CD81。當病毒漸漸靠近TJ處時，CLDN1和閉合蛋白對病毒的入吞至關(guān)重要[39]。

7.2 肝細胞癌(HCC) 大多數(shù)癌癥是上皮細胞形成的，而極性的缺失被認為是癌癥的標志和先決條件[40]。肝細胞極性的紊亂和喪失導(dǎo)致細胞黏附和連接的減弱，誘導(dǎo)EMT，最終促進HCC的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。其中，E-cadherin作為AJ的主要成分之一發(fā)揮著關(guān)鍵作用。E-cadherin在肝癌中的下調(diào)可由不同的機制引起。CD147是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，在肝腫瘤細胞中高表達，主要分布在細胞基底外側(cè)。CD147不僅能夠促進TGFβ1介導(dǎo)的肝細胞極性喪失，還能夠通過激活Src募集泛素連接酶直接誘導(dǎo)E-cadherin的泛素化和溶酶體降解，導(dǎo)致極性蛋白Par3表達減少和黏性連接蛋白β-catenin核易位，從而促進肝細胞去極化[41]?？张莸鞍追诌x蛋白33B(vacuolar protein sorting 33B，VPS33B)在維持肝細胞極性和HCC發(fā)生發(fā)展中也起著關(guān)鍵作用。VPS33B與肝細胞頂-基底外側(cè)極性調(diào)節(jié)蛋白VIPAR、囊泡轉(zhuǎn)運蛋白Sec22b和筏蛋白-1相互作用，調(diào)節(jié)和維持極性蛋白的分布。當VPS33B缺失時，可導(dǎo)致E-cadherin蛋白水平的降低，誘導(dǎo)肝損傷、進行性肝炎、肝纖維化和HCC[42]。此外，神經(jīng)生長因子是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，對神經(jīng)元細胞的生長和存活至關(guān)重要。有研究[43]在構(gòu)建穩(wěn)定過表達神經(jīng)生長因子的HepG2細胞系后，觀察到HepG2細胞中神經(jīng)生長因子過表達可破壞細胞極性，從而啟動EMT并促進癌細胞運動。上述證據(jù)提示，肝細胞極性穩(wěn)定受到破壞后，可促進HCC的發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移。

7.3 膽汁淤積性肝病 膽汁淤積性肝病是指由于膽汁的生成、分泌或流動發(fā)生障礙，導(dǎo)致肝內(nèi)外膽管中膽汁積聚，進而造成肝損傷。如前所言，肝細胞極性是肝細胞正常行使功能的基礎(chǔ)，而肝細胞的一項重要功能即為負責產(chǎn)生和分泌膽汁。如果肝細胞極性穩(wěn)定受到破壞，肝細胞內(nèi)蛋白質(zhì)定位發(fā)生異常，將導(dǎo)致肝細胞無法正常分泌膽汁，膽汁分泌量減少。膽汁鹽從肝臟的轉(zhuǎn)運是由位于小管膜上的膽鹽輸出泵介導(dǎo)的，膽鹽輸出泵缺乏往往是進行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥2型的主要原因[44]，患者往往在幾年內(nèi)進展為終末期肝病。此外，TJ蛋白異常也將導(dǎo)致膽汁淤積性肝病的發(fā)生。TJ蛋白2(TJP2)基因突變及其翻譯產(chǎn)物ZO-2缺乏可引起嚴重的肝內(nèi)膽汁淤積[45-46]。驅(qū)動蛋白超家族是一類在胞內(nèi)負責運輸物質(zhì)的分子馬達，與細胞極性有關(guān)。致病性驅(qū)動蛋白超家族成員12變異引起肝細胞極性紊亂，可導(dǎo)致膽汁淤積性肝病的發(fā)生[47]。膽汁淤積性肝病的發(fā)病機制往往被認為是肝細胞極性紊亂的結(jié)果，目前已經(jīng)確定多種蛋白質(zhì)/基因與肝細胞極性紊亂所致膽汁淤積性肝病相關(guān)，詳見表1。

表1 肝細胞極性紊亂所致膽汁淤積性肝病相關(guān)蛋白質(zhì)/基因

8 展望

肝細胞極性的建立和維持涉及多種蛋白質(zhì)分子及信號通路，了解其中具體分子機制對于與肝細胞極性相關(guān)疾病的預(yù)防和治療有著重大意義。眾多蛋白質(zhì)分子在行使其正常功能前，需在胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中完成翻譯后修飾這一過程，包括糖基化、磷酸化、甲基化等修飾形式。葡萄糖基-半乳糖基-羥基化是一種重要的翻譯后修飾，主要在含有膠原蛋白樣結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)中觀察到，如膠原蛋白、脂聯(lián)素等。前膠原半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1是前膠原蛋白進行葡萄糖基-半乳糖基-羥基化的一種糖基轉(zhuǎn)移酶，負責將半乳糖基轉(zhuǎn)移至前膠原蛋白特定羥化賴氨酸殘基上。此外，包括鈣黏蛋白在內(nèi)的多種細胞連接蛋白也需要進行N-糖基化等翻譯后修飾。由于膠原蛋白和蛋白聚糖是構(gòu)成ECM的核心結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的糖基化修飾可能是決定肝細胞極性發(fā)育及維持的關(guān)鍵。肝細胞小生境(niche)功能調(diào)控研究，在很大程度上決定了肝細胞極性的調(diào)控，其中膠原蛋白Glcα1和2Galβ1-等O-糖基化修飾對ECM小生境的影響，可能是未來肝細胞極性分子機制闡述的重要研究方向。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：毛元鵬負責擬定寫作思路，資料分析，撰寫論文；魏紅山負責課題設(shè)計，指導(dǎo)撰寫論文并最終定稿。